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       【摘要】 
       目的观察川芎嗪（TMP）对糖尿病肾病（DN）大鼠肾小管间质病变及转化生长因子-β1（TGF-β1）表达水平的影响。方法SD大鼠单侧肾切除链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病肾病动物模型。大鼠随机分为5 组，每组12只，分别为模型组,正常手术组，贝那普利（Lotensin）组，川芎嗪高、低剂量组。除空白组和模型组外，其余各组按组别分别予贝那普利1.7 mg/（kg·d）、川芎嗪150，50 mg/（kg·d）灌胃，共12周。实验第4周、第8周和第12周，测定尿微量蛋白排泄（UAER）；治疗12周，测定各组大鼠血清FPG，BUN，Scr，免疫组化检测肾小管间质TGF-β1表达。结果模型组大鼠UAER 进行性升高，FPG，BUN，Scr明显升高 (P＜0.01；P＜0.05)，肾小管间质TGF-β1表达明显增加（P＜0.01）。川芎嗪高剂量组大鼠UAER明显降低，FPG，BUN，Scr下降，肾小管间质TGF-β1表达明显减少，与模型组比较均有显著性差异（P＜0.05)。结论川芎嗪能下调DN大鼠肾小管间质TGF-β1表达，缓解肾小管间质损害，从而达到对DN肾功能的保护作用。
       【关键词】  川芎嗪 糖尿病肾病 转化生长因子-β1 病理
       糖尿病肾病（DN）是终末期肾衰竭的主要原因之一。DN发生的机制目前仍不十分清楚,涉及到一系列分子事件和组织学改变,特别是多种细胞因子通过不同途径、不同机制发挥重要作用。这些细胞因子通过旁分泌和自分泌方式发挥其病理生理作用，导致系膜细胞生长增殖，细胞外基质增加、增厚和系膜区扩张，促进DN的发生。DN时TGF-b1mRNA及其蛋白水平的升高与肾功能不全、系膜细胞增生和间质纤维化密切相关，参与了DN发生发展的多个环节［1，2］。川芎嗪是从中药川芎根茎中提取分离的生物碱单体，临床研究证实川芎嗪对ＤＮ具有显著的治疗作用［3］，但是否为通过干预DN肾小管间质损害，减少TGF-β1表达，进而达到其治疗目的，尚无报道。本研究即采用单肾切除链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病肾病模型，观察川芎嗪对其小管间质损害及转化生长因子-β1表达的干预，为其防治DN提供理论依据。
       1  材料与方法
       1.1  动物　　
       60只雄性清洁级Wistar大鼠（成都中医药大学实验动物中心提供），重量200～220 g。所有大鼠置于空气流通，温度18～25℃，湿度40%～70%的环境中，给予12 h光照，自由进食、饮水。标准化饲养房笼子驯化喂养1周，实验前禁食1 d。
       1.2  药品与试剂 
       盐酸川芎嗪片（50 mg/ 片）由北京市燕京制药厂生产(批准文号：国药准字H11021964)；贝那普利由北京诺华制药有限公司生产（批准文号：国药准字H20030514）；STZ购自Sigma公司；鼠抗人TGF-β1单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。
       1.3  动物模型及分组 
       1.3.1  糖尿病肾病模型的建立 
       将60只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后，常规消毒，从距右脊肋骨1.5 cm处斜向外方切口，于腹膜外暴露肾脏并剥离肾脏周围的脂肪组织，行右侧肾脏切除术。整个手术过程遵循无菌操作原则。术后2周，将其随机分为两组：正常手术组（n=12）和糖尿病模型组（n=48）。糖尿病模型组于禁食12 h后一次性腹腔注射STZ（纯度99.7%），临用前将STZ溶于0.1 mol/L，pH 4.2的无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中，终浓度为1%（冰浴中新鲜配制，随配随用），按60 mg/kg体重的剂量进行单次腹腔内注射，72 h后，尾静脉采血，测空腹血糖浓度＞16.7 mmol/L，尿糖阳性（与正常组比较P＜0.05），确定造模成功。
       1.3.2  分组及治疗 
       将造模成功糖尿病模型组48只大鼠随机分为4组：模型组（n=12），贝那普利对照组（n=12），川芎嗪低剂量组（n=12），川芎嗪高剂量组（n=12）；另设正常手术组12只，共5组动物。除模型组外，其余各组按组别每只分别予以贝那普利1.7 mg/（kg·d），川芎嗪50，150 mg/（kg·d），生理盐水灌胃2 ml，共12周。
       1.4   观察指标及方法
       1.4.1  空腹血糖(FPG)、肾功能［包括尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）］测定各组大鼠分别于治疗前和治疗后第6周与第12周，采用快速血糖仪与全自动生化分析仪检测。
       1.4.2  UAER测定  
       于治疗第4，8，12周各检测1次。
       1.4.3  肾脏病理学观察 
       于实验第12周将大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后，常规消毒，于腹膜外暴露肾脏并剥离肾脏周围的脂肪组织，摘取肾脏，常规固定，HE染色。
       1.4.4  肾间质TGF-β1蛋白表达
       采用免疫组化方法：肾组织常规脱蜡水化，3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶；用微波暴露抗原，封闭内源性生物素；滴加1∶10正常兔血清，10%小牛血清蛋白室温下孵育2 h，封闭非特异性抗原。滴加兔抗大鼠TGF-β1单克隆抗体（1∶200），4℃过夜。滴加生物素化二抗IgG（1∶200），37℃ 40 min；洗涤后室温下滴加DAB显色液，镜下控制显色时间。苏木素复染、1%盐酸酒精分化。常规脱水、透明、封片。实验均采用删除第一抗体作内阴性对照。在光镜200×视野下，随机选择10个视野，用Mias-2000图形分析系统进行分析。
       1.4.5  统计学处理 
       采用SPSS for Windows 10.0 统计软件进行统计分析，结果用±s表示，组间差异采用方差分析、t检验。
       2  结果
       2.1  各组大鼠肥大指数（肾重/体重）及血清生化变化   第12周时,与正常组比较,模型组大鼠肾脏体积明显增大,重量、肥大指数明显增高(P＜0.05），各治疗组与模型组比较，大鼠肾脏体积、重量及肥大指数均有不同程度的下降，而以川芎嗪高剂组下降最明显(P＜0.01）。第12周时,与正常组比较,模型组大鼠FPG，Bun，Scr明显增高(P＜0.05），各治疗组与模型组比较，FPG，Bun，Scr均有不同程度的下降。见表1～2。表1  各组大鼠肾重、体重及肥大指数比较（略）
       表2  各组大鼠FPG，BUN，Scr比较(略)
       2.2  各组大鼠UAER变化 
       与正常手术组比较，造模后第4周、第8周、第12周模型组UAER明显升高(P＜0.05)；与模型组比较，各治疗组UAER均有下降(P＜0.05或P＜0.01)；与贝那普利对照组相比，在第12周，川芎嗪高、低剂量组有显著性差异(P＜0.05）。与模型组比较，尽管随着时间的延长，各治疗组UAER不断上升，但在第8周和第12周UAER水平均呈下降趋势。见表3。表3  不同时期各组大鼠UAER比较(略)
       2.3  光镜观察  
       HE染色正常组未见异常；模型组可见肾间质明显灶性炎症分布和淋巴细胞浸润，肾小管明显扩张，基底膜明显增厚。用药各组上述病理改变均不同程度地减轻。尤其是川芎嗪高剂组仅见基底膜稍有增多，炎症不明显。
       2.4  肾间质TGF-β1蛋白表达 
       大鼠在造模后肾间质组织TGF-β1蛋白表达显著增加，与正常组比较具有显著性差异（P＜0.01）；与模型组比较，各药物治疗组大鼠肾间质组织TGF-β1蛋白表达均明显减少（P＜0.05）；与贝那普利组比较，川芎嗪各组无明显差异性（P＞0.05）。见表4。表4  TGF-β1阳性物质在肾小管间质表达(略)
       3  讨论
       STZ诱导糖尿病（DM）大鼠模型是目前国内外最为常用的糖尿病动物模型，但保留双肾的STZ糖尿病大鼠往往在很长时间后（6～9个月）才可以见到类似人类早期糖尿病肾病的病理改变，而人为切除单侧肾脏的造模方法可造成对侧肾脏高滤过和肥大，在此基础上给予STZ直接诱导DN，可以在较短时间内出现糖尿病的肾脏病理改变，缩短了造模时间，有利于对糖尿病的发病机制和药物干预作用的研究［4］。本实验结果表明，DM大鼠成模4周后，24 h尿蛋白排泄率即显著增加，肾小管扩张，基底膜增厚，说明单肾切除联合腹腔注射STZ致糖尿病大鼠在4周时已出现DN肾脏病理改变，模型制备成功。
       
       TGF-β1在肾脏表达最多，它是DN发病机制中的一个重要因素，其调控机制发生在基因转录及翻译后水平。大量临床和动物实验已证实DM时，高血糖、糖基化终末产物、肾素-血管紧张素-醛固酮系统及血脂代谢异常等因素均可使TGF-β1生物活性升高［5］，进而通过自分泌或旁分泌的方式作用于小管上皮细胞，控制其增殖和凋亡，调节基质合成和降解，激发免疫炎症反应，参与肾小管间质损伤的发生。其具体作用机制可能有：①促使肾脏肥大。TGF-β1能阻止肾小管上皮细胞从 G1期过渡到S期，但RNA、蛋白合成增加，从而表现为增殖抑制、细胞肥大。②诱导细胞外基质（ECM）蛋白合成；阻止新合成的ECM降解；增强细胞表面ECM受体-整合素的表达，加强细胞与基质黏附增强，促使ECM沉积。③TGF-β1过度形成或活性升高是肾脏纤维化过程中的最终调节因子，它具有强烈促纤维化作用。以上均表明，TGF-β1参与了肾小管间质损伤的发生、发展，而拮抗它的活性可阻止DN间质损害发生，延缓病情发展，这为DN的防治提供了潜在的治疗价值。
         
       川芎嗪又名四甲基吡嗪(TMP)是从伞形科藁本属植物川芎根茎中提取分离的生物碱单体,具有改善微循环、抗纤维化和拮抗钙离子等药理作用,对DN有很好的疗效。以往研究多集中在抑制血小板激活与聚集，改善血液流变学、抗氧化等方面，而对于DN状态下肾小管间质损害及TGF-β1的表达是否有干预作用，仍未见报道。本研究发现，在DN大鼠造模后第4周即出现大量蛋白尿，并且其肾间质中TGF-β1表达均明显增强，而经TMP治疗后，肾间质病理改变明显减轻，蛋白尿排泄减少，TGF-β1表达明显下调，表明TMP能通过减轻DN肾间质损害，减少蛋白尿排泄，降低肾间质中TGF-β1表达，从而发挥延缓肾功能损害进展的作用。
       【参考文献】
         　　［1］Lan S, Vander Ceest RN, Verhagen NA, et al. Seceetion of collogen type Ⅳ by human renal fibroblasts is increeased by high glucose via a TGF-bata-independent pathway［J］.Nephrol Dial Transplant, 2004，19:1694.
       
       ［2］Micahi, Thorp, DO.糖尿病肾病患者的处理［J］.中国全科医学，2005，8(17)：1407.
       
       ［3］邵倩,陈福琴. 川芎嗪在糖尿病肾病中的应用及其机制研究［J］.中国中西医结合肾病杂志，2002,3(12)：739.
       
       ［4］邢淑丽,郑君芙,黄文政. 单侧肾切除STZ诱导糖尿病肾病大鼠动物模型研究［J］.中国中医急症, 2006，15(6)：643.
       
       ［5］肖新怀，陈 澍. 拮抗转化生长因子 β活性对糖尿病肾病的防治作用［J］.中国药物与临床, 2006，6(10)：725.