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       【摘要】 
       目的优选淫羊藿黄酮类物质的制备工艺。方法设计了6 种提取工艺对粗毛淫羊藿黄酮类物质的制备进行了研究。结果6 种工艺提取物产量顺序为工艺6，1＞ 工艺2＞ 工艺3，4，5。不同工艺提取物总黄酮含量有极显著差异，其高低依次为：工艺3＞工艺1＞工艺2＞工艺4＞工艺5＞工艺6。工艺2，4，6提取物淫羊藿苷含量最高，其次是工艺3，均显著高于其余工艺，而工艺1 提取物的淫羊藿苷含量最低，平均值仅有0.70 %。结论工艺2 和3 较好，其提取物产量、总黄酮含量和淫羊藿苷含量均较高，对相关产业的发展具有一定的参考意义。
       【关键词】  粗毛淫羊藿 黄酮 淫羊藿苷 提取工艺
       Studies on Extraction Technology of Epimedium acuminatum Flavones
       SHENG Maoyin, YANG Qingxiong, CHEN Qingfu
       1  Institute of Plant Genetics and Breeding, School of Biological Technology and Engineering, Guizhou Normal University, Baoshanbeilu 116, Guiyang 550001, China；
       2.Department of Postgraduate, Guizhou Normal University, Baoshanbeilu 116, Guiyang 550001,China
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction technology of flavonoids from  E. acuminatum. MethodsSix extraction technologies were compared by the extracting output and the content of flavonoids and icariin.ResultsThe order of extracting output was Technology-6 and 1 ＞ Technology-2 ＞ Technology -4, 3 and 5. There were significant differences among flavone contents in extracts from six technics, with the order: Technology-3 ＞ Technology-1 ＞ Technology-2 ＞ Technology-4 ＞ Technology-5 and 6. The icariin contents of extracts from technology 2, 4, and 6 were the highest, Technology 3 the second, and they were all significant higher than the others. The icariin content of Technology-1 extract was the lowest, only 0.70%.ConclusionThe better extracting technologies are Technology 2 and 3, which have higher  extracting output,flavone and icarii contents from E. acuminatum than others.
       Key words：Epimedium acuminatum;   Flavoniods; Icariin;   Extracting technology
       淫羊藿(barrenwort)是我国著名的传统中药，为小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属Epimedium L.多年生草本药用植物，又名仙灵脾、羊合叶等［1］。早在《神农本草经》即记载其“主阴痿绝伤、茎中痛、益气力、强志”。《本草纲目》称其为“坚筋骨，益精气，补腰脾，强心力”。近年来，研究表明淫羊藿的药理主要集中在免疫、生殖系统、核酸代谢、心脑血管系统及抗衰老等方面，同时在抗肿瘤方面的药效研究也取得一定的进展［2］。目前的药理研究认为，该属植物的有效成分是总黄酮，其中核心成分是淫羊藿苷［3］。本属植物大多种类均可药用，以箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鲜淫羊藿和粗毛淫羊藿使用最多。其中，粗毛淫羊藿由于其具有巨大的野生蕴藏量，以及很高的总黄酮与淫羊藿苷含量，将会成为中药淫羊藿最主流品种之一［4］。
       
       中药提取物是指采用现代科学技术，对传统中药材进行提取加工而得到的具有相对明确药效物质基础以及严格控制标准的中药产品，可作为中药制剂的原料药和食品添加剂［5］。由于中药提取物的标准化相对于原材料标准化要容易得多，所以中药提取物的产业化是推进中药现代化和中药技术创新的重要环节，也是中药进入国际市场最现实的突破口。淫羊藿由于在药用、保健方面具有广泛的应用价值，导致其在提取物市场成为最热门品种之一，国内具有其生产能力的产家就多达数十家。目前淫羊藿提取物的标准是总黄酮与淫羊藿苷两种成分的含量。
        到目前为止，淫羊藿提取物产业，已具备了一定的规模，但该提取物的研制、生产、流通等各个环节都缺乏必要的管理规范，使得相关产品众多、规格杂、生产企业多而小、经营渠道杂、经营秩序混乱，致产品质量良莠不齐，这都阻碍了淫羊藿提取物产业化的更进一步发展。本研究设计了6 种提取工艺分别对粗毛淫羊藿进行了提取物的制备，并且对所得提取物的总黄酮与淫羊藿苷含量进行了测定、统计分析比较，来讨论6种提取工艺的优劣，对淫羊藿提取物的制备及其产业的进一步发展提供一定的参考。
       1 仪器与试剂
       Shimadzu LC-2010A型高效液相色谱仪，YMC Pack-ODS-A 150 mm×4.6mm 型HPLC色谱柱，Shimadzu UV-2450型紫外-可见光谱仪，Sartorius LE225D型电子分析天平，中国药品生物制品检定所的淫羊藿苷标准品（0737-200111），甲醇、乙腈均为色谱纯（默克公司）。
       
       实验材料为粗毛淫羊藿E. acuminatum Franch.，由贵州师范大学植物遗传育种研究所采集队采集于贵州省开阳县，凭证标本（标本号：05060301）存于贵州师范大学植物遗传育种研究所标本室。
       2  方法与结果
       2.1  6 种提取工艺及其提取物的得率
       2.1.1  6 种提取工艺的流程
       2.1.2  6种提取工艺的提取物得率及其多重比较每种工艺提取3 次，对所得结果运用生物统计方法中的多重比较［6］来分析这6 种提取工艺的提取物得率高低的次序。结果见表1。表1  6种提取工艺的提取物得率及多重比较（略）
       
       由表1可以看出，6 种工艺的提取物得率具有显著的差异，其中以工艺6 和工艺1 的得率最高，工艺2 次之。工艺3 与工艺4 的提取物得率没有极显著的差异，工艺5 的得率最差。
       2.2  6种提取工艺的提取物总黄酮含量测定
       2.2.1  对照品溶液制备精密称取干燥至恒重的淫羊藿苷对照品适量，用乙醇溶解，制成1 mg/ml的溶液作为对照品溶液。
       2.2.2   供试品溶液制备精密称取干燥至恒重的提取物0.1 g，用乙醇溶于100 ml的容量瓶中，超声30 min，放置冷却，定容，作为供试品溶液。
       2.2.3   最大吸收波长的测定分别精密称取对照品和供试品溶液1 ml，各置100 ml容量瓶中，按照标准曲线制备项下操作，用紫外分光光度计于220～400 nm波长范围内扫描，得紫外吸收光谱。结果表明，供试品紫外吸收曲线及最大吸收波长270 nm，与淫羊藿苷对照品完全一致，故采用270 nm波长测定供试品的吸收度。
       2.2.4   标准曲线的制备分别精密量取对照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml置100 ml容量瓶中，置80 ℃水浴中挥尽溶剂，放冷，加硫酸2 ml摇匀，置80 ℃水浴中加热30 min，放冷，置冰浴中加乙醇约80 ml，取出，放置至室温，加乙醇定容至100 ml，摇匀，照分光光度法，以第1 试管为空白，在270 nm波长处测定吸光度。以吸光度（X）对浓度（Y）作标准曲线，得回归方程为：Y ＝18.654 X + 0.587 6。相关系数r＝0.996 1。结果表明，浓度在5～20 μg/ml范围内，与吸收度呈线性关系。
       2.2.5   回收率实验取已知含量的样品5 份，精密称取，分别加入一定量的淫羊藿苷对照品，按照标准曲线制备项下操作，结果回收率为101.95 %，RSD为1.46 %（n=5）。
       2.2.6   稳定性实验精密称取供试品溶液1 ml，按照标准曲线制备项下操作，依法测定吸收度。间隔1，2，3，4 h再分别测定1次，计算RSD为1.09 %。表明样品在4 h内稳定。
       2.2.7  精密度实验精密量取对照品溶液1 ml共5 份，按照标准曲线制备项下操作，分别测定吸收度，结果RSD为1.45%（n=5）。
       2.2.8   重现性实验取同一样品5 份，分别按供试品的含量测定项下操作。结果RSD为1.56 %，表明重现性良好。
       2.2.9   供试品总黄酮含量测定精密量取供试品溶液1 ml，按照标准曲线制备项下操作，在270 nm波长处测定吸收度，按回归方程计算含量（每种提取物平行测定3 次）。对6 种提取工艺提取物的总黄酮含量进行多重比较分析［6］。结果见表2。表2  6种不同工艺提取物总黄酮含量及多重比较结果（略）
       
       由表2 可以看出，各工艺提取物间的总黄酮含量均有极显著差异。总黄酮的含量的高低依次为：工艺3＞工艺1＞工艺2＞工艺4＞工艺5＞工艺6。
       2.3   6种提取工艺的提取物淫羊藿苷含量测定
       2.3.1  色谱条件参照《中国药典》的方法［7］，色谱柱为YMC Pack ODS-A 150 mm×4.6 mm；流动相为乙腈-水（25∶75）；流速：1.0 ml/min；柱温30 ℃；检测波长270 nm；进样量：10 μl。
       2.3.2   对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的淫羊藿标准品，用色谱甲醇配制成0.1 mg/ml，作为对照品溶液。
       2.3.3  标准曲线的制备分别吸取淫羊藿对照品溶液2，4，6，8，10 μl上机测定，记录色谱图，以进样量（μl）对峰面积（A）进行线性回归。经计算回归方程为：Y = 2 820 119 X - 49 987.3，相关系数r = 0.995，结果表明淫羊藿苷在0.2～1 μg/ml范围内与HPLC峰面积线性关系良好。
       2.3.4   供试品溶液的制备分别精密称取干燥至恒重的6 种提取工艺的提取物，用80 %的乙醇溶于50 ml容量瓶。超声30 min，放置冷却，定容。用0.45 μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
       2.3.5  稳定性实验在室温条件下，精密吸取样品溶液在1，2，3，4，12，24 h内进行测定，RSD为1.64%，说明供试品溶液在24 h内稳定。
       2.3.6  精密度实验取0.1 mg/ml的淫羊藿苷标准品溶液连续5次进样，峰面积RSD为2.12%。
       2.3.7   重现性实验取供试品溶液进行5 次平行试验，淫羊藿苷的含量RSD为1.73%。
       2.3.8   加样回收率实验精密称取已知淫羊藿苷含量的样品粉末1.5 g 3份，准确加入淫羊藿苷标准品适量，依法测定，计算回收率。结果平均回收率为99.85%，RSD=1.85%。
       2.3.9   供试品淫羊藿苷含量测定运用上述淫羊藿苷含量测定方法对6种提取工艺的提取物淫羊藿苷含量进行测定，对所得结果运用生物统计学中的多重比较进行分析［6］。结果见表3。表3  6 种不同工艺提取物的淫羊藿苷含量及多重比较（略）
       由表3可以看出，工艺2，4，6提取物淫羊藿苷含量最高，而且彼此没有差异性，其次是工艺3，它们都显著高于其余工艺。工艺1提取物的淫羊藿苷含量最低，平均值仅有0.70 %。
       3  讨论
       目前关于不同淫羊藿黄酮提取工艺的比较研究很少。本研究设计了6 种工艺对淫羊藿黄酮提取效果进行了研究。其中，工艺6 提取物产量最高，淫羊藿苷含量也很高，但总黄酮含量太低，暗示有大量其它藿苷类成分丢失，不是一个好的工艺。工艺1 提取物产量和总黄酮含量都很高，但淫羊藿苷含量太低，也不是一个好的工艺。工艺4 和5 提取物产量太低，而且总黄酮和淫羊藿苷含量均偏低，应该不是好的工艺。工艺3 提取物产量中等，但总黄酮的含量最高，淫羊藿苷含量也较高。工艺2 提取物产量中等，总黄酮含量中上水平，淫羊藿苷含量最高。显然，工艺2 和3 应该是较好的可以采纳的工艺。考虑到工艺2 更简单易行、生产成本低，应该是本研究中的最佳工艺。
       马维坤等［3］通过正交实验分别对淫羊藿总黄酮的水提工艺及醇提工艺进行了多因素研究，结果显示醇提优于水提，80%的乙醇提取效果最好。刘敏等［2］也认为，乙醇提取率较水提好，溶出杂质少，有利于后续分离，且溶剂可回收，适于工业生产。本研究中，工艺5提取物的总黄酮、淫羊藿苷的含量均较低，暗示水提取的效果明显不如乙醇提取好，与马维坤等［3］和刘敏等［2］的研究结果一致。本研究中最佳淫羊藿提取工艺（工艺2）运用了澄清剂处理，显著地提高了提取物中淫羊藿苷的含量，对改进提取工艺有一定意义。
       【参考文献】
         　　［1］贵州植物志编写组.贵州植物志,第9卷［M］.贵阳:贵州人民出版社,1990:57.
       
       ［2］刘 敏,周 芳,黄少伟,等.淫羊藿总黄酮的提取工艺及含量分析［J］．时珍国医国药,2007,18(1):31.
       
       ［3］马维坤,陈 文,段国峰.淫羊藿总黄酮提取分离工艺研究［J］.中医药学刊,2006,24(3):539.
       
       ［4］孟宪丽,曾 南,张 艺,等.淫羊藿有效成分对老年大雄性大鼠下丘脑单胺类神经递质及其他脑功能作用的研究［J］.中国中药杂志,1996,21(11):683.
       
       ［5］侯团章.中草药提取物,第1卷［M］.北京:中国医药科技出版社,2004:344.
       
       ［6］杜荣骞.生物统计学［M］.北京:高等教育出版社,海德堡:施普林格出版社,1999:90.
       
       ［7］国家药典委员会.中国药典,Ⅱ部［S］.北京:化学工业出版社,2005:229.