高效液相色谱法测定葛根、红花和山楂混合提取物中葛根素、羟基红花黄色素A的含量
作者:李桥,宋恬,王光忠,刘焱文
作者单位:湖北中医学院·中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室,湖北 武汉 430061
《时珍国医国药》 2008年 第8期
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【摘要】
目的建立一种反相高效液相色谱方法,测定葛根、山楂、红花混合提取物中葛根素和羟基红花黄色素A的含量。方法采用Hypersil ODS 4.6 mm(i..d.)×250 mm,5μm,以0.2%(V/V)磷酸水溶液∶甲醇∶乙腈(81∶16∶3)为流动相,流速1.2 ml/min,柱温25℃,检测波长分别为250,403 nm,测葛根素和羟基红花黄色素A。结果葛根素和羟基红花黄色素A线性范围分别为0.032 406~0.162 08 mg/ml和0.029 4~0.147 mg/ml;平均加样回收率分别为98.3%,98.0%;RSD分别为1.2%,1.6%。结论该方法快速、简便、准确,可为评价该提取物的质量提供依据。
【关键词】 葛根素 羟基红花黄色素A 高效液相色谱法
Determination of Puerarin and HSYA in Extracts of Radix Puerariae, Fructus Crataegi and Carthamus tintorius by HPLC
LI Qiao,SONG Tian,WANG Guangzhong,LIU Yanwen
Hubei College of TCM, Province and Ministry Established Key Laboratory of Resonrce Science and Compledx Prescription in Traditional Chinese Medicine
Abstract:Objective:To establish an RP -HPLC method for the determination of the content of Puerarin and HSYA in the extracts from Radix Puerariae,Fructus Crataegi and Carthamus tintorius.MethodsThe HPLC system consisted of Hypersil ODS column(250 mm× 4.6 mm,id 5 μm) with phosphoric acid (0.2%):methanol :acetonitrile (81:16:3)mixture as mobile phase, the flow rate was 1.2 ml/min, the detection wavelength was 250,403 nm respectively for determination of Puerarin and HSYA, and the column temperature was 25℃. ResultsThe linearity ranges of Puerarin and HYSA were in the range of 0.032 406~0.162 08mg/ml and 0.0294~0.147mg/ml respectively, the average recoveries of adding sample were 98.3% and 98.0%,the RSD(n=5) were 1.2% and 1.6% respectively. ConclusionThe method is simple , fast and accurate. It can be used for the quality control of the extracts of Radix Puerariae, Fructus Crataegi and Carthamus tintorius.
Key words:Puerarin ; HSYA ; HPLC
脑得生方是《中国药典》经典方[1],由三七、山楂、川芎、红花和葛根组成。葛根、山楂、红花中黄酮类成分具有抗血栓和改善脑循环的作用。本研究建立葛根山楂红花总黄酮提物含量测定方法,为进一步纯化该提取物黄酮类成分及二次开发奠定基础。
1 仪器和试药
1100型HPLC仪,含UV-VIS检测器,chemstation数据处理系统(美国Agilent公司);BP 211D电子天平(sartorius公司);葛根素,羟基红花黄色素A对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用);试剂均为分析纯,甲醇(上海振兴化工一厂),乙腈(国药集团化学试剂有限公司),磷酸(武汉化学试剂厂);实验室用水为自制双蒸水。葛根、红花、山楂提取物(实验室自制批号20070621,20070712,20070823)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Hypersil ODS 4.6 mm(i..d.)×250 mm,5μm;流动相:0.2%(V/V)磷酸水溶液∶甲醇∶乙腈(81∶16∶3);检测波长250 nm(测葛根素),403 nm(测羟基红花黄色素A);流速1.2 ml/min; 柱温25℃ ,进样量10 μl。
2.2 对照品溶液的制备
称取葛根素、羟基红花黄色素A适量,加40%的乙醇配成浓度分别为0.081,0.147/mg·ml-1对照品溶液,密封置冰箱保存。
2.3 供试品溶液的制备
称取提取物粉末约0.06 g,精密称定,加40%的乙醇定容至100 ml。取上述溶液适量过0.45 μm滤膜,制成供试品(测葛根素样品); 另称取提取物粉末约0.68 g,精密称定,加40%的乙醇定容至50 ml。取上述溶液适量过0.45 μm滤膜,制成供试品(测羟基红花黄色素A样品)。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系考察
葛根素线性关系:分别吸取浓度为(mg/ml):0.032 46,0.064 862,0.009 724 8,0.129 664,0.162 08葛根素对照品溶液10 μl,进样记录色谱峰峰面积,以进样浓度(mg/ml)作为纵坐标,吸收峰面积为横坐标,得回归方程:C=3×10-5A+0.002 5(r=0.999 9)。结果表明葛根素在32.406~162.08 μg/ml范围内线性关系良好。
羟基红花黄色素A线性关系:分别吸取浓度为(mg/ml)0.029 4,0.058 8,0.088 2,0.117 6,0.147羟基红花黄色素A对照品溶液10 μl,进样记录色谱峰峰面积,以进样浓度(mg/ml)作为纵坐标,吸收峰面积为横坐标,得回归方程:C=5×10-5A+0.002 2(r=0.999 9)。结果表明葛根素在29.4~147 μg/ml范围内线性关系良好。
2.4.2 稳定性考察
分别精密吸取样品供试液在8 h内每隔2 h测定1次,每次进样量为10 μl,测得样品中葛根素峰面积的RSD为0.80%(n=5);羟基红花黄色素A峰面积的RSD为0.59%(n=5)。
2.4.3 精密度考察
分别吸取葛根素和羟基红花黄色素A对照品溶液10 μl连续进样5次,测得葛根素峰面积的RSD为0.86%,为羟基红花黄色素A面积的RSD为0.74%。
2.4.4 重复性实验
取同一批号样品按供试品溶液的制备方法平行制备5份,按上述色谱条件进行测定,测得样品中葛根素和羟基红花黄色素A峰面积的RSD分别为0.5%,1.73%。
2.4.5 回收率实验
平行称取已知含量的提取物物粉末各5份,加入定量的葛根素,羟基红花黄色素A对照品,按照样品测定方法测定。结果表明,葛根素和羟基红花黄色素A平均加样回收率分别为98.3%(RSD=1.2%)和98.0%(RSD=1.6%)。
2.5 样品含量测定 按上述方法对3批提取物进行含量测定计算样品中葛根素和羟基红花黄色素A的含量。结果见表1及图1~2。表1 样品中葛根素和羟基红花黄色素A的含量(略)
3 讨论
考虑到羟基红花黄色素A和葛根素都显酸性,考察了磷酸不同浓度,结果发现0.2%磷酸水溶液分离效果好。实验室还考察了甲醇-磷酸水,乙腈-磷酸水系统,发现葛根素,羟基红花黄色素A均不能达到完全分离。由于中药复方成分复杂,采用0.2%(V/V)磷酸水溶液∶甲醇∶乙腈(81∶16∶3)三元系统洗脱,得到满意效果。
实验中尝试在同一波长下同时测定葛根素和羟基红花黄色素A,结果发现很难同时使两个成分的都有较好线性,且精密度不易同时达到要求,故采用在不同波长下分别测定。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005:572.