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       【摘要】 
       目的探讨款冬花提取物、总生物碱部位、非生物碱部位和克氏千里光碱（senkirkine）对小鼠肝脏的毒性作用。方法小鼠灌胃给予款冬花水提液、醇提液、总生物碱、非生物碱、克氏千里光碱及腹腔注射克氏千里光碱，连续给药7 d后，测定体重变化、肝脏指数，血清中GOT，GPT，TBIL的含量，并进行肝脏病理组织学检查。结果总碱组、克氏千里光碱口服和腹腔注射组显著抑制小鼠体重增加，血清生化指标显著升高，克氏千里光碱两组的肝脏指数明显增加。病理切片显示，水提组与对照组形态学无差异；总碱组形态学有所改变，肝细胞呈轻度细胞水肿，可见肝细胞点状坏死，肝小叶及汇管区未见炎细胞浸润；克氏千里光碱两组肝细胞均呈不同程度细胞水肿，可见肝细胞点状和碎片状坏死，肝小叶及汇管区可见少量炎细胞浸润。结论在所给剂量下，水提液无肝脏毒性，用药安全；总生物碱、克氏千里光碱有明显的肝脏毒性。
       【关键词】  款冬花 肝脏毒性 小鼠 血清生化指标 病理组织学
       Hepatotoxicity of Flos Farfarae and the Contained Alkaloid to Mice
       ZHANG Yan, HUANG Fang, WU Di,ZHANG Mian
       1. Key Laboratory of Modern Chinese Medicines of Ministry of Education, China Pharmaceutical University, Nanjing, Jiangsu 210038, China;
       2. China Pharmaceutical University, Nanjing, Jiangsu, 210038, China
       Abstract：ObjectiveTo study the hepatotoxicity of the water and ethanol extracts, the total alkaloid and non-alkaloid parts of Flos Farfarae, as well as senkirkine, a pyrrolizidine alkaloid isolated from Flos Farfarae in mice. MethodsMice were given the aqueous and alcoholic extracts oraly, the total alkaloid and non-alkaloid parts, senkirkine (senkirkine-IG), respectively, and also intraperitoneal given senkirkine (senkirkine-IP), for 7 days. Hepatic injury effects were measured by experimental data of body weight, coefficient of liver, levels of GOT, GPT and TBIL in serum of mouse; histological examination of mouse liver was also carried out. ResultsThe total alkaloids, senkirkine IG or IP significantly inhibited the weight gain and increased the levels of GOT, GPT and TBIL in serum of mice; the senkirkine-IG and IP obviously increased the coefficient of liver. Compared with the control group, the results of histopathologic examination of the mouse liver showed that the livers of mice took the aqueous extract were not injured, the ones took the total alkaloids were slightly injured, and the ones took senkirkine (IG and IP) were significantly injured. ConclusionThe aqueous extract of Flos Farfarae is not toxic to liver of mice at the experimental dose, but the total alkaloids and senkirkine are toxic to liver of mice.
       Key words：Flos Farfarae;   Hepatotoxicity;   Mice;   Serum biochemical indicators;   Histopathologic examination
       款冬花为菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，又称冬花，性温、味辛，具有润肺下气、止咳化痰之功效，临床上主要用于新久咳嗽、喘咳痰多、劳嗽咳血等症［1］，为止咳平喘方剂中的常用中药。但是，化学成分的研究表明款冬花中含有具有肝脏毒性的吡咯里西啶生物碱（hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids, HPAs）［2］。据报道，款冬花药材中含的HPAs有senecionine和senkirkine［3］，所以其临床使用的安全性引起了世界各国的重视［4］，部分国家明令禁止使用款冬花［5］。款冬花的毒性到底如何，是否可以在临床上继续使用，目前尚无实验性文献报道。为了探讨款冬花的毒性及其大小，本研究就款冬花不同提取物（水提物，醇提物），提取部位(总生物碱部位，非生物碱部位)，以及HPAs单体克氏千里光碱（senkirkine）对小鼠有无肝脏毒性进行了研究。
       1  材料与方法
       1.1  材料、药品及仪器
       款冬花，购于安徽亳州，经中国药科大学生药学研究室张勉教授鉴定为款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾。水提组：款冬花药材加10倍量水热回流提取3次，合并提取液，浓缩至0.5 g/ml；醇提组：款冬花药材加10倍量90％乙醇热回流提取3次，合并提取液，回收乙醇，浓缩至0.5 g/ml；总碱组（总生物碱部位）：醇提液回收至无醇味，用2.5％稀盐酸调pH至2～3，酸水用氯仿萃取（回收氯仿得残渣I，待用）后，酸水层用5％稀NaOH调pH至10～11，碱水用氯仿萃取，回收氯仿即得；非碱组（非生物碱部位）：上述氯仿萃取后的碱水用稀盐酸调至中性，与残渣I合并，浓缩至折合生药量为0.5 g/ml，即得；克氏千里光碱由本研究室从款冬花中分离得到。总碱和克氏千里光碱以0.5% CMC-Na混悬，供小鼠灌胃用。
       
       谷丙转氨酶测定试剂盒（GPT），批号20070423；谷草转氨酶测定试剂盒（GOT），批号20070423；血清总胆红素测定试剂盒（TBIL），批号20070423；均为南京建成生物工程研究所产品。离心机，常州国华电器有限公司。1500酶标仪，Thermo Electrom公司。
       1.2  动物 
       ICR小鼠，雄性，体重（20±2）g，江苏南京青龙山动物繁殖场提供。
       1.3 方法 
       取健康小鼠70只，随机分成7组，每组10只，分别为空白对照组、水提组、醇提组、总碱组、非碱组、克氏千里光碱口服（senkirkine-IG）组和腹腔注射（senkirkine-IP）组。其中水提组、醇提组、总碱组、非碱组和senkirkine-IG组以0.2 ml/10 g灌胃，1次/d；senkirkine-IP组以0.2 ml/10 g腹腔注射；对照组灌胃等量CMC-Na溶液。连续给药7 d，正常饮食饮水。在第7天给药1 h后，称重，摘眼球取血，离心取血清检测GPT,GOT，TBIL，并摘取肝脏称重，计算肝脏指数（肝重mg/体重g）。取同一部位肝脏，福尔马林固定，HE染色，观察病理变化［6］。
       2  结果
       2.1  对体重、肝脏指数的影响见表1。与对照组相比，总碱组、克氏千里光碱口服组和腹腔注射组对小鼠正常的体重增长有明显抑制作用，抑制程度为senkirkine-IP组> senkirkine-IG组>总碱组。水提组、醇提组、非碱组均对小鼠正常的体重增长未见抑制作用。克氏千里光碱口服组和腹腔注射组肝脏指数显著增加。表1  款冬花提取物对小鼠体重及肝脏指数的影响(略)
       2. 2  对血清GPT，GOT，TBIL的影响见表2。水提组的各项生化指标与对照组相比均无差异。与对照组比较，醇提组、senkirkine-IG和IP组使GOT水平显著升高，总碱组、非碱组与对照组的差异均具有统计学意义；总碱组、senkirkine-IG和IP组均使GPT水平显著升高，醇提组、非碱组有显著差异；总碱组使TBIL显著升高。
       表2  款冬花提取物对小鼠血清GOT，GPT，TBIL的影响(略)
       2. 3  对肝脏组织形态的影响见图1。由小鼠肝脏病理切片结果可见，与空白组（a）相比较，水提组（b）和醇提组（c）形态学无明显差异；非碱组（d）和总碱组（e）肝细胞呈轻度细胞水肿，可见肝细胞点状坏死，肝小叶及汇管区未见炎细胞浸润；Senkirkine-IG（f）和senkirkine-IP（g）组肝细胞呈不同程度细胞水肿，可见肝细胞点状坏死和碎片状坏死，肝小叶及汇管区可见少量炎细胞浸润。
       3  讨论
        《中国药典》Ⅰ部（2005年版）收载款冬花的临床用量为每日5～9 g（最高用量为15 g［7］），本实验水提组剂量按人体重折合为约600 g/d，为临床高剂量的60余倍(为最高用量的40倍)，其各项指标与空白组比均无差异，病理组织切片显示形态学正常，提示只要不超量使用，款冬花水煎液是安全的。同剂量的醇提组与水提组相比，除血清GPT，GOT数值较空白组有所升高外，其他各指标均与水提组无差异，未出现明显肝脏器质性病变，其药用的安全性有待进一步的研究。
       
       总碱组和非碱组血清GPT，GOT，TBIL数值均升高，肝细胞呈轻度细胞水肿，可见肝细胞点状坏死，肝小叶及汇管区未见炎细胞浸润，此外总碱组还显著抑制小鼠体重增加，提示存在一定的肝脏毒性。
       
       Senkirkine-IG和IP组均显著抑制小鼠体重增加，血清GPT，GOT，TBIL数值显著升高，肝脏指数显著增加。肝细胞呈不同程度细胞水肿，可见肝细胞点状坏死和碎片状坏死，肝小叶及汇管区可见少量炎细胞浸润，提示有明显的肝脏毒性，与文献报道的吡咯里西啶类生物碱具有肝脏毒性一致。
       本实验结果表明，款冬花按照其传统的用量（5～9 g/d）和用法（水煎）入药是安全的，没有明显的肝脏毒性。这可能是由于款冬花中的吡咯里西啶类生物碱含量很低（所以总碱组折合成生药的量很大），而且该类生物碱极性又较小不易溶于水，致使水煎液中毒性物质的量远远低于致毒剂量。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：233.
       
       ［2］濮社班, 徐德然, 张 勉，等. 中药款冬中肝毒吡咯里西啶生物碱的LC/MSn检测［J］.中国天然药物, 2004, 2(5)：293.
       
       ［3］Roeder E. Medicinal plants in China containing pyrrolizidine alkaloids［J］.Pharmazie, 2000, 55(10): 711.
       
       ［4］曾美怡, 李敏民, 赵秀文. 含吡咯双烷生物碱的中草药及其毒性(二)——冬花和伪品蜂斗菜等的毒性反应［J］.中药新药与临床药理, 1996, 7(4): 51.
       
       ［5］刘可越, 张铁军, 高文远，等. 款冬花的化学成分及药理活性研究进展［J］.中国中药杂志, 2006, 31(22): 1840.
       
       ［6］刘树民, 李玉洁, 罗明媚，等. 黄药子肝毒作用影响因素的实验研究［J］.中国中医药信息杂志, 2004, 11(7): 598.　
       
       ［7］肖培根. 新编中药志，Ⅱ［M］.北京: 化学工业出版社, 2002: 802.