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       【摘要】 
       目的探讨大鼠后肢活动和便秘的关联性及推拿干预对远端结肠c-kit表达的影响, 以研究推拿治疗便秘的作用机制。方法剪除大鼠后肢股骨，建立便秘模型，经推拿治疗后，分别提取各组大鼠结肠远端细胞总蛋白, 采用免疫蛋白印迹(Western blot)蛋白半定量方法检测各组标本c-kit蛋白表达的变化。结果Western blotting 显示便秘模型大鼠结肠远端c-kit蛋白表达明显下降（P＜0.01）；推拿干预后，c-kit蛋白表达明显增加（P＜0.01）。结论大鼠后肢活动减少而引发便秘，可使大鼠结肠远端c-kit的蛋白表达减少；经推拿干预后，可使便秘大鼠结肠远端c-kit的蛋白表达显著提高，提示推拿治疗便秘与cajal 间质细胞（ICC）数目变化有关。
       【关键词】  便秘 c-kit 免疫印迹 推拿
       Effect of Manipulation on the Expression of c-kit Protein in Rat with Constipation
       ZHAO Wenshu, LU Jingen, CAO Yongqing
       (Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China)
       Abstract：ObjectiveTo approach the relativity of constipation with the decrease of leg activity, and the effect of manipulation on the expression of c-kit protein in rat"s colon with constipation. MethodsModels of constipation were made by cutting both femur of rat. After manipulation was done, expression of c-kit protein was detected by western-blotting. ResultsThe expression of c-kit protein of rat"s colon was obviously reduced on model group (P＜0.01) . The expression of c-kit protein of rat"s colon was obviously increased after treating of manipulation (P＜0.01). ConclusionThe expression of c-kit protein of rat"s colon was obviously reduced by decreasing the activity of hind limb. The expression of c-kit protein of rat"s colon was obviously increased after treating of manipulation. We can deduce that the changes of numbers of ICC are related to the manipulation in treating constipation.
       Key words：Constipation；  C-kit；  Western blotting;  Manipulation
       长期卧床患者常便秘，骨折的卧床患者也便秘，根据上述观察建立大鼠便秘模型。推拿是治疗便秘的有效方法，但治疗机制研究报道较少。Cajal细胞在胃肠运动中的重要作用已被证实，Cajal细胞的数目和功能的改变将引起胃肠蠕动的异常，c-kit是卡哈耳氏细胞的标记物，运用免疫印迹方法检测大鼠结肠远端c-kit蛋白的表达，来揭示Cajal细胞数目的改变，从而阐明推拿治疗便秘的机制。
       1  材料与仪器
       1.1  研究对象
       上海斯莱克实验动物有限公司提供10周龄、18周龄雄性SD大鼠各32只，随机分成8组即高龄（18周）正常对照组8只、高龄模型对照组8只、乳果糖治疗组8只、推拿干预组8只；低龄（10周）正常对照组10只、低龄模型对照组8只、乳果糖治疗组8只、推拿干预组8只。除正常对照组外，其他各组均剪除双后肢股骨1.0 cm, 单笼饲养8周后，开始治疗，2个月检测各项指标。
       1.2  仪器与试剂
       1.2.1  仪器高速离心机、分光光度仪、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
       1.2.2  试剂单去污剂裂解液、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、10X丽春红染液、封闭液、显影液、定影液、c-kit（sc-168）兔多抗购于santa cruz公司。
       2  方法
       2.1  造模方法具体操作如下：SD-大鼠用20％乌拉坦，按0.4 ml／100 g体重给药，腹腔注射麻醉后，仰卧固定于木板上，75％酒精消毒下肢内侧及腹部皮毛，从膝关节向上剪除大腿内侧1 cm×2 cm大小被毛，再用安尔碘消毒局部皮肤，从膝关节向上剪开2 cm皮肤，用11号刀片挑开鼠膝关节，先向下分离股骨下端附着的韧带肌腱，将股骨远端从膝关节中分离出来，此处操作应小心，否则会引起血管损伤而出血，提起股骨远端向上剥离骨膜1 cm，用18 cm弯骨剪在股骨四周剪切一圈，不可用力过大，否则会剪碎股骨，断端不齐术后有刺破大血管的风险，剪掉股骨下端1 cm后，分别缝合肌肉、皮下组织和皮肤，手术完毕，单笼饲养。模型剪单腿组剪除单侧股骨；模型剪双腿组剪除双侧股骨。
       2.2  干预方法推拿干预组用QGAWA-PM30电动按摩进行电动按摩，取足三里、天枢、中脘、关元穴，2次/d，每穴3 min，持续治疗8周；乳果糖组采用乳果糖稀释液灌胃作疗效对照。
       2.3  Western blot方法
       2.3.1  电泳从各蛋白样品中取等量蛋白（50 μg）与1×SDS凝胶上样缓冲液混合，定容到相同体积，加入1 μl的β-ME(β-Mercaptoethenal)，一起煮沸。在4℃下，12 000 r/min，离心5 min。
       
       蛋白上样，经由12%SDS-PAGE分离胶分离，浓缩胶50 v, 40 min; 分离胶 100 v电泳到溴酚蓝至底边1/3处。
       2.3.2  转膜PVDF膜用甲醇浸湿，去离子水冲洗，再转移到Transferring buffer中平衡20 min；电泳胶置Transferring buffer中平衡20 min；裁6张与胶同样大小的Whatman 3MM滤纸，置Transferring buffer中平衡；按下列顺序装好blot：负极—3层滤纸—电泳胶—PVDF膜—3层滤纸—正极。300 mA转膜120 min。转印至PVDF膜上。
       2.3.3  封闭将此膜取下，剪角后在5%脱脂奶粉封闭液中缓慢摇动2～4 h。
       2.3.4  一抗孵育将一抗按1∶500稀释，与膜一起孵育4℃过夜。
       2.3.5  二抗孵育用1×PBST洗涤3～4次，10 min/次。将此膜与Hrp标记的二抗（1∶3 000）一起孵育2 h,室温。
       2.3.6  检测用1×PBST洗涤3～4次，10 min/次。 将检测试剂ECL的A液与B液以1∶1的比例混合，检测试剂的用量为0.1 ml/cm2 。 室温下，与ECL反应50sec。 吸干多余的检测试剂；膜用保鲜膜封起，暗室曝光，时间：30 s。用美国BIO-RAD公司Quantity  One 分析软件对显影条带进行灰度分析，将目的蛋白与GAPDH灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达水平。
       2.4  统计学处理实时定量数据采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析和t检验，数据以均数±标准差（±s）表示，以P值表示统计学差异，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异非常显著。
       3  结果
       复制卧床便秘大鼠模型两个月后，开始推拿干预，持续治疗两个月，利用Western blot方法进行蛋白的半定量分析，分别提取各组大鼠结肠远端总蛋白，以GAPDH为内参，各组c-kit 蛋白的相对表达量分别为：高龄正常组2.06±0.31；高龄模型组0.48±0.08；高龄推拿组1.82±0.23；高龄乳果糖组0.49±0.10。低龄正常组2.38±0.87；低龄模型组0.60±0.15；低龄推拿组2.00±0.30；低龄乳果糖组0.64±0.06。大鼠远端结肠c-kit的蛋白表达见图1。
       经Western blot检测结果显示，高龄模型组与高龄正常组相比c-kit的蛋白表达明显减少（P＜0.01），说明造模可使Cajal细胞减少；高龄推拿组与高龄模型组相比c-kit的蛋白表达明显增加（P＜0.01），说明推拿可使Cajal细胞数有明显恢复；高龄推拿组与高龄乳果糖组相比c-kit的蛋白表达有显著差异（P＜0.01），说明推拿干预比乳果糖对便秘的治疗更有效，见图2。 
       经Western blot检测结果显示，低龄模型组与低龄正常组相比c-kit的蛋白表达明显减少（P＜0.01），说明造模可使Cajal 细胞减少；低龄推拿组与低龄模型组相比c-kit的蛋白表达明显增加（P＜0.01），说明推拿可使Cajal细胞数有明显恢复；低龄推拿组与低龄乳果糖组相比c-kit的蛋白表达有显著差异（P＜0.01），说明推拿干预比乳果糖对便秘的治疗更有效，见图3。
       根据Western blot检测结果分析，高龄正常组（2.06±0.31）与低龄正常组（2.38±0.87）之间相比无明显差异（P＞0.05）；高龄模型组（0.48±0.08）与低龄模型组（0.60±0.15）之间无明显差异（P＞0.05）；高龄推拿组（1.82±0.23）与低龄推拿组（2.00±0.30）之间无明显差异（P＞0.05），说明便秘的推拿干预的效果与年龄因素相关性不大。
       4  讨论
       c-kit是一种编码跨膜型酪氨酸受体的原癌基因，在人类位于染色体4q11-12，该基因主要表达于肥大细胞、黑色素细胞、造血干细胞、肠间质细胞和生殖细胞等，存在于肠壁特定区域的肠间质细胞被认为是胃肠道平滑肌蠕动的起搏器细胞，因为ICCs能激发一种自发性慢波［1］。Deniel等［2］研究显示在正常肠道内ICCs呈现出自动节律性，而在ICCs之间以及ICCs与肠壁平滑肌细胞之间存在着电性耦联。这种电性偶联的存在对于整个肠肌层的电生理活动是必需的。当ICCs激发的自发性慢波传到肠壁环肌层引起一点兴奋时，通过电性耦联兴奋能在环肌层按三维方向扩布，并使一段肠产生协同性收缩，引起肠道的蠕动。Ward等［3］报道小鼠E位点(c-kit的等位基因)的自发性突变可引起肠壁内围绕神经节的起搏区内ICCs的显著减少，从而引起肠肌层自发性慢波活动消失，肠蠕动失协调而出现假性肠梗阻，从而得出结论认为，在小鼠肠道ICCs的发育中c-kit是起关键作用的一种信号分子，对肠自主性运动的产生所必需的起搏器系统的发育c-kit是必不可少的。Piotrowska等［4］研究显示在人正常的肛门内括约肌肌纤维和肌间神经丛中均存在有许多c-kit＋ICCs。
       实验采用的多个腧穴相互配伍，足三里(足阳明胃经的合穴)，可治腹胀，便秘，虚劳羸瘦，疳积，完谷不化。现多用于胃或十二指肠溃疡，消化不良等。国内外关于研究电刺激足三里对胃肠运动影响的实验较多［5～6］。Iwa等［7］研究报道电针刺激大鼠双侧后肢足三里穴可显著加快结肠传输；天枢(大肠募穴)可治腹痛，腹胀，便秘。现多用于阑尾炎、肠麻痹、消化不良等。配大肠俞、足三里，有温通气机，调理肠腑的作用；中脘(胃募穴、腑会穴)可治腹胀，饮食不化。《循经》：一切脾胃之疾，无所不疗。研究进展：针刺中脘穴对小肠的蠕动有促进作用，尤其能促进空肠的蠕动；关元(小肠募穴)可治小腹痛，完谷不化，泄泻。现多用于肠炎、肠粘连、小儿单纯消化不良等。四穴相配，共同促进肠道传输。
       本实验从后肢运动减少的角度创立慢传输大鼠便秘模型，通过推拿干预后，经Western blot检测大鼠结肠中段c-kit的蛋白的表达，实验结果说明，大鼠结肠卡哈耳氏细胞的特异标记物经推拿治疗表达增加，因此推测，推拿治疗有恢复卡哈耳氏细胞数量的趋势，并且推拿对便秘的疗效与年龄因素无关。推拿治疗便秘，方法简单，疗效确切，但治疗的机制研究较少，从生理学上看，首先，刺激-反应是因果关系，刺激减少必然导致反应减缓，下肢（后肢）活动是胃肠道正常功能的有效刺激，若其减少会产生肠道运动缓慢的结果。其次，功能和结构是辨证的关系，长期功能的异常，会导致结构的改变，卡哈耳氏细胞减少。推拿疗法可被看作是一种高级的刺激，使卡哈耳氏细胞数量和功能的恢复成为可能，这也可能是推拿治疗便秘的的机制之一。
       【参考文献】
         　　［1］Thunberg L, Rumessen J, Mikkelsen H, et al. Structural aspects of interstitial cells of Cajal as intestinal pacemaker cells［M］. Boce Raton FL: CRC,1995,193.
       
       ［2］Huizinga J, Liu L, Blennerhassett M, et al. Intracellular communication in smooth muscle［J］. Exoerientia, 1992, 48:932.
       
       ［3］Ward S, Burn A, Torihashi S, et al. Mutation of the proto-Oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine ［J］. J Physiol (Lond),1994,480:91.
       
       ［4］Piotrowska A P, Solari V, Puri P. Dictribution of interstitial cell of Cajal in the internal anal sphincter of patients with internal anal sphincter achalasia and Hirschsprung disease ［J］. Arch Pathol Lab Med, 2003, 127(9):1192.
       
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       ［6］Ouyang H, Yin J, Wang Z, et al. Electroacupuncture accelerates gastric emptying in association with changes in vagal activity ［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2002, 282(2):G390.
       
       ［7］Iwa M, Matsushima M, Nakade Y, et al. Electmacupuncture at ST-36 accelerares colonic motility and transit in freely moving conscions rats ［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2006, 290(2):G285.