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       【摘要】 
       目的研究银杏叶中抗氧化活性物质的最佳提取工艺。方法应用微波辅助提取法提取银杏叶抗氧化活性物质，以清除DPPH自由基的IC50值为活性跟踪指标，采用正交实验对浸提条件进行了优化。结果最佳提取工艺为：微波辐射时间20 min，乙醇体积分数70%，固液比1∶20(g：ml)，提取温度50℃。 结论按此优化条件进行提取，平均IC50值为1.29 μg/ml，银杏总黄酮得率可达到3.1%。
       【关键词】  正交实验 微波提取 银杏叶 抗氧化活性物质
       Leaves Study on Microwave Extraction of DPPH Free Radical Scavenging Substances from Ginkgo biloba
       LUO Zheng，LI Xiangzhou*，OUYANG Nana
       College of Materials Science and Engineering, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, China
       Abstract：ObjectiveTo study the optimum extraction process of antioxidative substances from Ginkgo biloba leaves. MethodsMicrowave assisted extraction (MAE) was used to extract antioxidative substances from Ginkgo biloba leaves. The extraction conditions of antioxidative substances from Ginkgo biloba leaves were studied by orthorhombic analysis and IC50 of scavenging DPPH free radical was used as the activity monitoring parameter.ResultsThe optimum extraction conditions were:20 min, extraction time, 70% ethanol at 50℃, and a material/solvent ratio of 1:20(g:ml).Conclusion Under this condition, IC50 of scavenging DPPH free radical of antioxidative substances from Ginkgo biloba leaves is 1.29 μg/ml while the yield of flavonoids of Ginkgo biloba leaves is 3.1%.
       Key words：Orthogonal test method;   Microwave assisted extraction;   Ginkgo biloba leaves;   Antioxidative substance
       近20年来，活性氧和自由基研究成为现代生命科学的热点，评价和筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。银杏作为我国特有的树种资源，因其全身的药用价值而得名，目前的研究主要集中在银杏叶的开发和利用上。银杏叶提取物化学成分很复杂，主要活性成分为黄酮类化合物及萜类内酯,此外,还有有机酸、烷基酚和烷基酚酸氨基酸、单宁、甾体化合物及微量元素等［1，2］，具有较强的清除自由基和抗氧化作用，是开发天然抗氧化剂的重要来源。
       微波技术是近20年来国内外迅速发展的新技术，其在植物提取方面的应用已有多项专利授权［3］，由于其特殊的加热机制可以在很大程度上缩短提取时间［4］，同时还可以减少溶剂的消耗等优点而广泛应用于传统中药黄酮类［5］、皂苷类［6］、多糖［7］以及挥发油等［8］活性成分的提取研究。然而，目前大多数的研究主要集中在天然产物活性成分的得率上，以抗氧化效果为提取考察指标的研究较少。作者以清除DPPH自由基的IC50值为活性跟踪指标，采用正交实验法对银杏叶抗氧化活性物质进行微波辅助有机溶剂提取，考察了微波辅助提取的条件，优选出了银杏叶抗氧化活性物质的最佳浸出方案。
       1  器材
       MAS－I型微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；电子天平（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）；循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；UV－1201紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）。DPPH，Sigma公司产品；芦丁标准品；其它药品试剂均为分析纯；水为实验室自制新鲜蒸馏水。银杏叶（采购于长沙市药材市场）买回后叶片与叶柄分开，叶片在烘箱中50℃烘至手捏碎，粉碎，过40～80目筛备用。
       2  方法
       2.1  标准曲线的绘制精确称取无水芦丁对照品20 mg于50 ml容量瓶中，用30%乙醇定容，再移取25ml芦丁溶液至另一个50 ml容量瓶中，用30%乙醇定容。分别移取上述溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml于25 ml容量瓶中，补加30％乙醇至12.5 ml，加入1 ml 5% NaNO2， 6 min后加1 ml 10%Al(NO3)3，6 min后加10 ml 4%NaOH，用30%乙醇定容，摇匀，15 min后于508 nm处以试剂空白为参比，测定吸光度。以浓度-吸光度进行回归，绘制标准曲线，求得回归方程：A=11.095C+0.009 1，C为芦丁含量（mg/ml），A为吸光度，相关系数 r=0.999 8，表明在该浓度范围内线性关系良好。
       2.2  银杏叶微波提取物总黄酮含量的测定称取2.0g干燥银杏叶于圆底烧瓶中，加入相应浓度的溶剂，在一定微波辐射条件下提取一定时间，得到滤液，离心分离，移取1 ml上层清液于25 ml容量瓶中，按“1.2.1”项中标准曲线绘制的测定方法，在508 nm处测定其吸光度A，并从芦丁浓度和吸光度的关系式中，得出芦丁浓度C ( mg/ml )，经过换算求出银杏叶中的总黄酮得率。
       2.3  银杏叶抗氧化活性物质的微波辅助提取银杏叶抗氧化活性物质浸提工艺单因素实验。
       溶剂体积分数的选择：40～80目干燥银杏叶中分别加入其质量25倍的50%，60%，70%，80%体积分数的乙醇溶液后于50℃提取20 min。
       微波辅助提取温度的选择：40～80目干燥银杏叶中加入其质量25倍的60%乙醇溶液后分别于40，50，60，70和80℃提取20 min。
       微波提取时间的选择：40～80目干燥银杏叶中加入其质量25倍的60%乙醇溶液,然后在50℃下分别提取10，15，20，25和30 min。
       固液比的选择：40～80目干燥银杏叶中分别加入其质量15，20，25和30倍的60%乙醇溶液，于50℃提取20 min。
       银杏叶抗氧化活性物质浸提工艺正交实验：在单因素实验基础上，采用L9(34)正交实验对微波提取温度、微波提取时间、料液比和乙醇体积分数进行试验，考察其对银杏叶活性物质的抗氧化性能的影响，对其提取条件进行优化。然后，按此优化条件进行银杏叶抗氧化活性物质的提取。
       2.4  银杏叶抗氧化活性物质浸提液的抗氧化活性的测定DPPH贮备液的配制：准确称取DPPH试剂0.257 7 g，用无水乙醇(分析纯)溶解，并定量转入1 000 ml容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀得质量浓度为257.7 mg/L DPPH贮备液(约6.5×10-4mol/L)，置于冰箱中冷藏备用，使用前用无水的乙醇稀释。
       清除DPPH自由基能力的测定：将DPPH贮备液稀释至质量浓度为51.54 mg/L使用。在试管中依次加入4.0 ml DPPH溶液和1.0 ml样品提取溶剂，混匀后用1 cm比色皿在517 nm波长处测吸光值(A)，记为A0；加入4.0 ml DPPH溶液和1.0 ml待测试液，混匀后在黑暗处静置20 min，测定值记为Ai；加入4.0 ml无水乙醇溶液和1.0 ml待测试液，混匀后测定值，记为Aj，按下式计算自由基清除率。
       清除率（％）＝［1－（Ai－Aj）/ A0］×100%
       
       抗氧化剂清除DPPH自由基能力采用清除的IC50值表示。自由基的清除能力IC50定义为：自由基清除率为50%时所需的样品有效质量浓度。IC50值越小，抗氧化剂的自由基清除能力越强。
       3  结果
       3.1  乙醇体积分数对银杏叶抗氧化活性物质清除率的影响乙醇体积分数对银杏叶抗氧化活性物质DPPH清除率IC50值的影响见图1。
       从图1可以看出，IC50值随乙醇体积分数的增大而增大，银杏叶活性物质抗氧化效果随乙醇体积分数的增大而减小。这是由于不同乙醇体积分数中银杏叶抗氧化活性物质的含量不尽相同。有研究认为：黄酮并不是银杏叶提取物中的唯一抗氧化有效成分，有机酸、氨基酸、单宁、生物碱等极性较大的活性成分也有相当强的抗氧化能力，并且它们之间还可能存在协同抗氧化作用［9］。因此，要使银杏叶活性物质抗氧化效果达到最好，乙醇体积分数不能过大，其选择范围应该在70%左右。
       3.2  提取温度对银杏叶抗氧化活性物质清除率的影响
       提取温度对银杏叶抗氧化活性物质DPPH清除率IC50值的影响见图2。从图2可以看出，40～60℃时，IC50值随温度的升高而减小，在60℃时IC50值达到最小，说明在此点银杏叶提取物抗氧化效果达到最强，温度继续升高，IC50值上升很快，银杏叶提取物抗氧化效果变差。这是由于银杏叶提取物中一些多酚类物质的稳定性较差，受热发生氧化或水解反应，从而导致抗氧化效果变差。因此，银杏叶抗氧化活性物质的提取温度不宜过高，初步确定正交实验的温度范围为50～70℃。
       3.3  提取时间对银杏叶抗氧化活性物质清除率的影响
       提取时间对银杏叶抗氧化活性物质DPPH清除率IC50值的影响见图3。
       从图3可以看出，提取时间从10～25 min时，IC50值随时间的增加而减小，在25 min时达到最小值，即抗氧化效果达到最强。但随着提取时间进一步延长，IC50值缓慢上升，抗氧化效果有所下降。这可能与银杏叶提取物中一些活性物质的不稳定性有关。因此在时间因素的选择上，以20 min左右为宜。
       3.4  固液比对银杏叶抗氧化活性物质清除率的影响
       固液比是影响银杏叶抗氧化活性物质提取的重要因素之一。适当的固液比既可使原料中的抗氧化活性物质得到充分提取，还可减少溶剂的消耗及其回收成本。固液比对银杏叶抗氧化活性物质DPPH清除率IC50值的影响见图4。
       从图4可以看出，随着溶剂量的增加，IC50值在固液比1∶20时达到最低，即银杏叶活性物质抗氧化效果在固液比1∶20时达到最佳。对于银杏叶活性成分乙醇浸提过程，提取溶剂与活性成分的结合是物理过程，提取溶剂的量增大时，活性成分与溶剂的接触机会增多，且不会造成活性成分在溶剂中达到饱和的情况，浸出率自然增加，其抗氧化效果则达到最佳。
       然而固液比继续增加，曲线中的IC50值继续上升然后还有下降的趋势，这一现象还有待在以后的实验中进一步研究。
       3.5  银杏叶抗氧化活性物质提取条件的优化根据单因素实验结果，以清除DPPH自由基的IC50值为主要考查指标，采用L9(34)正交实验考察了微波辐射时间(A)、乙醇体积分数(B)、固液比(C)和提取温度(D)对银杏叶抗氧化活性物质提取的影响。结果见表1。表1  微波辅助提取银杏叶抗氧化活性物质正交实验结果
       实验（略）
       
       从表1的正交实验结果可知，A、B、D 3因素对银杏叶活性物质的抗氧化影响均比较明显，其中浓度对银杏叶活性物质的抗氧化影响最大，而固液比对银杏叶活性物质的抗氧化影响不明显。4种因素的影响大小顺序为：B>A>D>C。银杏叶抗氧化活性物质最佳条件组合为A3B2C1D1，即最佳提取工艺条件为：微波辐射时间20 min，乙醇体积分数70%，固液比1∶20(g∶ml)、提取温度50℃。按此优化条件进行提取，重复3次实验，平均IC50值为1.29 μg/ml，银杏总黄酮得率可达到3.1%。4  结论
       
       以清除DPPH自由基的IC50值为活性跟踪指标，通过正交实验优化银杏叶抗氧化活性物质的最佳浸提方案为：采用微波辅助技术，微波辐射时间20 min，乙醇体积分数70%，固液比1∶20(g∶ml)，提取温度50℃。按此优化条件进行提取，重复3次实验，平均IC50值为1.29 μg/ml，银杏总黄酮得率可达到3.1%。
       微波辅助提取银杏叶抗氧化活性物质的抗氧化效果与乙醇体积分数、提取温度和提取时间密切相关，而固液比对银杏叶抗氧化活性物质清除DPPH自由基抗氧化效果影响不明显。
       【参考文献】
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