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       【摘要】 
       目的观察原卟啉钠体内外抗乙肝病毒作用。方法体内实验采用先天感染鸭乙肝模型，检测给药前、给药后5 d、10天及停药后3 d鸭血清 DHBV-DNA的动态变化；体外实验采用2.2.15细胞为模型，检测用药后对细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的抑制作用。结果体内实验显示，给药第5，10 d时鸭血清DHBV-DNA其OD值均明显低于给药前，差异有显著性意义(P<0.05)；体外实验显示，原卟啉钠在所稀释的各浓度下，对细胞分泌HBsAg，HBeAg均有一定的抑制作用，对HBsAg，HBeAg的治疗指数分别大于188.7和64.5。结论原卟啉钠体内外均具有明显的抗乙肝病毒作用。
       【关键词】  原卟啉钠 鸭乙型肝炎病毒 2.2.15细胞株
       The AntiHBV Effect of Protoporphyroin Disodium in Vitro and in Vivo
       FAN Qiaoyun, LIU Qunhong, WANG Jian
       （School of Medicine, Anhui University of Science & Technology ，Huainan 232001，China)
       Abstract:ObjectiveTo observe the inhibitory effect of NAPP on Hepatitis B virus in vitro and in vivo. MethodsDuck model of congenital infection of HBV was used in the in vivo test. DHBV-DNA in serum was detected by dot-hybridization test before treatment, 5 days and 10 days after treatment. The cell 2.2.15 line was taken as cell model. The inhibitory effect of NAPP on HBsAg and HBeAg secreted by 2.2.15 cells was evaluated with ELISA method.ResultsIn the animal model, the optic density value of DHBV-DNA in duck serum was reduced markedly after treatment  with NAPP for 5 days and 10 days, there was remarkable difference (P<0.05). In the cell model, NAPP had obvious inhibitory effect on HBsAg and HBeAg in different concentrations. The therapeutic index of NAPP was greater than 188.7 for HBsAg and 64.5 for HBeAg. ConclusionNAPP has a certain inhibitory effect on Hepatitis B virus in vitro and in vivo.
       Key words:Protoporphyrin disodium (NAPPP)；  Duck hepatitis virus B；  2.2.15 cell culture
       
       抗病毒治疗目前是治疗乙型病毒性肝炎的关键，而现有的抗病毒药物多数具有治疗后长期应答率不够理想以及较多的副作用等问题，所以寻找新的、高效低毒抗乙肝病毒药物就显得尤为重要，原卟啉钠分子式C34H32N4O4Na2，化学名为1，3，5，8-四甲基-2，4二乙烯基卟吩-6，7-二丙酸钠(Protoporphyrin Disodium NAPP)，是由四个吡咯环经四个次甲基键连接而成的含共扼双键的大环化合物，可由血红蛋白的辅基血红素经人工提取、加工而成的。近年来有研究报道，NAPP体外具有抗乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）的作用［1］。为了进一步明确其抗病毒效果，本研究对NAPP体内外抗HBV作用进行了实验研究。现报道如下。
       1  材料
       1.1  药物
        
       原卟啉钠（NAPP），本实验室提取，纯度94.1%；拉米夫定葛兰素史克制药（苏州）有限公司生产，批准文号：国药准字H20030581。
       1.2  动物　
       1 日龄龙岩麻鸭 35只，雄性，体重（50±5）g，购自石井潮阳村孵化场，常规饲养。饲料：宝鼎501小鸭饲料，由穗屏企业有限公司饲料厂生产。
       1.3  试剂　
       缺口翻译平移试剂盒购自美国 Promega CO公司；α-32P- dCTP 购自北京市亚辉生物医学工程公司；NC膜购自Amersham公司；DHBV质粒由广州中医药大学热带病研究所病毒室保存；Sephadex G-50购自Pharmacia公司； MEM干粉、胎牛血清购自GIBCO公司； HBsAg，HBeAg 抗原检测试剂盒购自上海科华生物工程公司；MTT检测试剂盒购自北京碧云天公司；PCR试剂盒购自华美生物工程公司。
       1.4  HepG 2.2.15 细胞 　
       引自上海复旦大学医学院分子病毒实验室。
       2  方法
       2.1  体内实验
       2.1.1  动物的分组及给药方法1日龄龙岩麻鸭购回后喂养2 d后，自胫静脉取血，离心，收集血清，用斑点杂交的方法检测DHBV-DNA，第13天出结果，筛选出先天自然感染鸭后进行下一步实验。将DHBV-DNA阳性鸭随机分为3组：模型组、拉米夫定组和NAPP组，每组8只。NAPP组和拉米夫定组每天按20 mg/（kg·d）剂量口服给药，模型组以生理盐水代替药物，连续给药10 d。分别于给药前、给药后5 d、给药后10 d及停药后第3
       天采集血样，分离血清，-70℃冻存待检。
       2.1.2  鸭血清DHBV-DNA的检测
       采用 DHBV-DNA Dot Blot法测定［2］。取上述鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平，观察其动态变化。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32P标记DHBV-DNA探针，将40 μl血清点于硝酸纤维膜上，然后杂交，放射自显影，在酶标检测仪上测定OD值（滤光片波长为490 nm）。
       2.2  体外实验
       2.2.1  细胞毒性检测根据Mosmann等建立的四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测药物细胞毒性。具体方法：用胰酶消化HepG 2.2.15细胞后，调整细胞浓度至2×104 cell/ml，加入96孔培养板中，每孔100 μl，每个浓度设3孔，培养24 d，吸去上清后加入含有不同浓度药物（1 ，10-1，10-2，10-3，10-4 mg/ml）的DMEM培养基。作用72 d之后，各孔中加入10 μl的MTT并继续培养4 h，去上清，每孔加入100 μl DMSO，轻轻振荡使甲臜溶解，测570 nm波长下吸光度的OD值。计算细胞存活率和各种药物的半数毒性浓度TC50，TC50是实验组存活细胞为对照组的50%时的药物浓度。细胞存活率（%）=［（OD实验孔－OD空白对照）／（OD细胞对照－OD空白对照）］×100%，TC50= Antilog［ B + (50-<50%破坏百分率) ×C / （>50%破坏百分率-<50%破坏百分率）］
       
       C = A - B，A = log>50%药物浓度   B = log <50%药物浓度
       2.2.2  药物对细胞分泌的HBsAg、HBeAg抑制作用  HepG 2.2.1 5细胞胰酶消化后，接种于24孔培养板，每孔1 ml，培养4 d后换用含药培养液，并设拉米夫定为阳性对照组。根据药物毒性实验结果，确定药物的浓度，每浓度加3孔，同时设不加药细胞对照3孔及培养液空白对照3孔，并于第3，6天更换新鲜的含药液培养，第9天收集各孔细胞上清液，-20℃冷冻。采用ELISA法检测上清液中HBsAg，HBeAg。药物对抗原的抑制百分率（%）=［（OD细胞对照－OD实验孔）／（OD细胞对照－OD空白对照）］×100%，IC50为HBsAg，HBeAg抑制率为50%时的药物浓度。治疗指数TI=TC50/IC50。
       2.3  统计学处理　
       F分析配对t检验 采用SPSS11.5软件包进行统计分析。
       3  结果
       3.1  体内实验各实验组用药后不同时间光密度值与同组给药前光密度值的比较。（见表1）。NAPP组在给药后第5天鸭血清DHBV-DNA水平有较明显下降，与给药前自身比较，差异有显著性(P<0.05)，第10天与给药前自身比较，差异有显著性意义(P<0.01)。拉米夫定组在给药后第5天DHBV-DNA水平明显下降，与给药前自身比较，差异有显著性意义(P<0.01)。表1  NAPP对鸭乙肝模型血清病毒滴度的抑制作用(略)
       3.2  体外实验NAPP对HepG 2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用见表2～3。由表2可知，NAPP和拉米夫定的各浓度组与细胞对照组相比HBsAg，HBeAg的OD值差异均有显著性（P<0.05）。NAPP的各剂量组之间HBsAg，HBeAg的OD值差异有显著性（P<0.05）。NAPP组各浓度与拉米夫定组各浓度相比，对 HBsAg，HBeAg抑制差异无显著性（P>0.05）。表2  药物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用(略)表3  NAPP和拉米夫定对HBsAg，HBeAg 的治疗指数药物TC50(略)
       用TI来评价NAPP的抗HBV效果。当TI>2时，受试药物高效低毒，TI越大，则表明该药对HBV的抑制作用越强，细胞毒越小［3］。由表3可知， NAPP对HBsAg，HBeAg的治疗指数分别大于188.7和64.5，提示对HBsAg，HBeAg的分泌均有抑制作用且毒性低。
       4  讨论
       由于鸭乙肝病毒生物学特性及感染特点与人乙型肝炎病毒类似，已被作为研究人乙型肝炎病毒的重要动物模型［4］，所以本实验采用先天感染的鸭乙肝模型，研究NAPP体内抗乙肝病毒的作用。实验结果显示，阳性药物拉米夫定按20 mg/（kg·d）剂量，连续灌胃10 d，可显著抑制DHBV-DNA，停药3 d DHBV-DNA显著回升，与临床结果相吻合，说明本次实验是成功的。受试药物原卟啉钠10 d疗程中，各时点DHBV-DNA变化差异也有显著性意义(药后5 d，P<0.05；药后10 d，P<0.01)，停药3 d DHBV-DNA显著回升，提示NAPP在鸭体内对DHBV-DNA有明显抑制作用。
       HBV-DNA转染人类肝癌细胞株HepG2所建立HepG的
       2.2.15细胞株能有效表达 HBV复制的全部标志，是体外评价HBV药物的较好模型。本实验结果表明，NAPP在所稀释的各浓度下对HepG 2.2.15细胞分泌HBsAg，HBeAg均有一定的抑制作用，且抑制作用与药物浓度呈一定的剂量依赖关系。NAPP和拉米夫定的治疗指数都远远大于2，提示NAPP和拉米夫定皆为高效低毒型药物。
       
       本研究显示NAPP在体内外可有效抑制乙肝病毒的复制，其抑制病毒效果与拉米夫定相近，且毒副作用小，所以NAPP有望成为治疗乙型病毒性肝炎的一种新药，有进一步研究的价值。
       【参考文献】
         　　［1］Chao-Pin Li, Li-Fa Xu, Hong-Qun Liu, et al. Extraction of protoporphyrin disodium and its inhibitory effects on HBV-DNA［J］.World J Gastroenterol, 2004, 10(3)：433.
       
       ［2］陈渊卿，顾健人，蒋惠秋，等. 斑点杂交试验直接检测血清中乙型肝炎病毒DNA［J］. 中华传染病杂志, 1983,1(2)：63.
       
       ［3］何金洋，郭兴伯，朱宇同，等. 复方肝毒清对乙型肝炎病毒的体内外抑制作用［J］.广州中医药大学学报, 2004,21(2)：134.
       
       ［4］Mason WS, Seal G, Summers J, et al. Virus of Pekin ducks with structural and biological relatedness to human hepatitis B Virus［J］.Virol, 1980, 36：829.