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       【摘要】 
       目的研究中华补血草根提取物（the extract of Limonium sinense Ktze root, LSE）对小鼠急性肝损伤的防护作用及药理机制。方法建立小鼠D氨基半乳糖/脂多糖（DGalN/LPS）肝损伤模型，检测LSE对血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的影响；观察肝脏组织超微结构的变化；测定肝线粒体膜电位以及线粒体对高钙诱发肿胀的敏感性的变化。结果一定剂量（100～400 mg·kg-1）LSE能有效抑制DGalN/LPS引起的小鼠血清AST及ALT活性的显著上升；明显减轻肝损伤引起的小鼠肝脏组织超微结构的破坏；抑制线粒体膜电位的降低以及线粒体对外加高钙诱发肿胀敏感性的下降。结论LSE对DGalN/LPS诱导的急性肝损伤具显著的防护作用，其机理可能与保护肝脏线粒体、抑制肝细胞凋亡有关。
       【关键词】  中华补血草 D-氨基半乳糖/脂多糖 肝损伤 线粒体
       Protective Effect of the Extract of Limonium sinense Ktze Root against Acute Liver Injury Induced by D-galactosamine and Lipopolysaccharide
       TANG Xinhui1,  GAO Jing2,CHEN Jin3, XU Lizhi2
       1.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Coastal Wetland Bioresources and Environmental Protection; School of Life Science and Technology, Yancheng Normal College, Yancheng, Jiangsu, 224002，China;
       2.School of Pharmacology, Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu, 212013，China；
       3.School of Medicine, Nanjing University, Nanjing Jiangsu 210093，China
       Abstract：ObjectiveTo study the hepatoprotective effect of the extract of Limonium sinense (Girard) Ktze root (LSE)  on acute liver injury induced by Dgalactosamine and lipopolysaccharide (DGalN/LPS) and its mechanism. MethodsDGalN/LPS-induced liver injury model was used to evaluate the effect of LSE on the activities of serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in mice. Ultrastructure of liver was observed and liver mitochondrial membrane potential and mitochondrial swelling were measured following DGalN+ LPS injection without or with LSE. Results100 mg·kg-1, 200 mg·kg-1 or 400 mg·kg-1 LSE could significantly inhibit the increase of serum AST and ALT activities induced by DGalN/LPS improve morphological changes in liver and inhibit the decrease of mitochondrial membrane potential and sensitivity of mitochondrial swelling to the exotic Ca2+ stimulation .ConclusionLSE has hepatoprotective activity and the mechanisms  may be related to its protection on liver mitochondria.
       Key words：Limonium sinense (Girard) Ktze;   D-Galactosamine and Lipopolysaccharide;   Liver damage; Mitochondria
       中华补血草Limonium sinense (Girard) Kuntz，又名匙叶草、盐云草、海菠菜、海赤芍等，为白丹花科补血草属Limonium Mill.多年生泌盐草本植物，喜生于沿海盐渍化的低洼湿地上，广泛分布于我国东北、华北及陕、甘、宁和苏北等地区。除具有较高观赏价值、环境保护等作用外，具有一定药用价值。据记载，该植物具有补血、止血、散淤、调经、益脾、健胃等多种功效，目前临床上主要用于治疗功能性子宫出血症，学者们对中华补血草药理作用的研究也主要集中在其抗菌止血方面［1］。成分分析表明，该植物化学成分十分丰富，含有多糖、鞣质、萜类、黄酮类以及氨基酸、矿物质等等［2，3］，推测中华补血草可能具有其它功效。最新的研究初步发现，中华补血草提取物能抑制CCl4及DGalN肝损伤动物血清转氨酶活性的升高［4］，提示该植物可能具有对抗肝损伤作用。然而中华补血草的护肝作用还缺乏全面、深入的研究，其药理机制有待于进一步考察。
       本课题拟采用DGalN/LPS小鼠急性肝损伤模型，运用形态学观察，酶活力测定以及线粒体膜电位测定、肿胀敏感性测定等方法，研究中华补血草根提取物对小鼠急性肝损伤的防护作用并探讨其药理机制。
       1  材料与仪器
       1.1  中华补血草根提取物（LSE）的制备中华补血草采集于江苏盐城滩涂，由江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室于延球副教授鉴定。取中华补血草干燥全根100 g，粉碎，用蒸馏水提取1～3次，合并提取液，浓缩、干燥，即得棕色干粉32.9 g（得率32.9 %）。
       1.2   动物 
       ICR小鼠，雄性，体重18～22  g，购自南京医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（苏）2002-0031。
       1.3  仪器
       7520分光光度计，上海分析仪器厂产品； Biofuge Primo R 冷冻离心机，Kendro 公司产品；Hitachi 7600-020全自动生化分析仪、Hitachi 850型荧光分光光度计，日立公司产品； Flexi-DryTM冷冻干燥仪，Stone Ridge公司产品；JEM100CX透射电子显微镜，日本电子公司产品。
       1.4  试剂D
       氨基半乳糖（DGalN），脂多糖（LPS）, 罗丹明（Rh123），甘露醇、蔗糖、EDTA、琥珀酸、鱼藤酮，购自Sigma公司；TrisHCl，Hepes，购自Promega公司。
       2  方法
       2.1  DGalN/LPS急性肝损伤模型的建立  小鼠分5组：正常组；D-GalN/LPS损伤组；100，200，400 mg·kg-1LSE组。正常组和损伤组小鼠以0.2 ml·10 g-1体重生理盐水连续灌胃5 d，LSE各剂量组则分别以不同浓度LSE同样方式灌胃；第6天正常组小鼠按0.2 ml·（10 g）-1腹腔注射生理盐水，其余组小鼠腹腔注射600 mg·kg-1 DGalN；1 h后，除正常组小鼠腹腔注射0.2 ml·（10 g）-1生理盐水外，其它各组腹腔注射LPS（10 mg·kg-1），同时小鼠给予禁食不禁水。LPS注射12 h后，取血，分离血清，待测血清ALT，AST活力。处死小鼠后，取部分肝组织固定，待制备肝组织电镜切片，其余肝组织匀浆，制备肝脏线粒体。
       2.2  酶活力的测定 
       分离得到的各组小鼠血清，用全自动生化分析仪测定血清ALT及AST活性。
       2.3  形态学观察 
       所取各组小鼠肝组织，用4%戊二醛溶液中预固定，1 %四氧化锇再固定，制备肝组织电镜切片，透射电子显微镜观察肝细胞超微结构。
       2.4  线粒体的制备
       据Apprille法［5］，将肝组织在预冷的分离液（包括225 mmol·L-1甘露醇， 75 mmol·L-1蔗糖， 50 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1 TrisHCl, pH 7.4）中剪碎，洗净，匀浆，500×g离心5 min，取上清液，8 800×g离心10 min，弃上清液，沉淀即为线粒体，用分离液洗3次，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。
       2.5  线粒体膜电位的测定 
       按照Emaus法，使用荧光染料罗丹明（Rh123）测定线粒体的膜电位值（DYm）。测定时各处理组小鼠线粒体按0.5 mg·ml-1重悬于测定缓冲液（含225 mmol·L-1 D甘露醇, 70 mmol·L-1蔗糖, 5 mmol·L-1  Hepes, pH 7.2）中，在25℃条件下分别与0.3 mmol·L-1Rh123共孵3 min后，荧光分光光度计测定各组线粒体悬液的荧光强度（激发波长505 nm，发射波长534 nm），并计算膜电位的值。计算公式为：DYm=-59 log ［Rh123］in/［Rh123］out［6，7］。
       2.6  线粒体肿胀敏感性的测定 
       线粒体肿胀程度根据线粒体悬液在波长为540 nm 处的吸光值测定。各组小鼠肝脏线粒体按1.0 mg·ml-1重悬于测定缓冲液（125 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1KCl，2 mmol·L-1 KH2PO4，5 mmol·L-1琥珀酸，5 mmol·L-1鱼藤酮，10 mmol·L-1Hepes, pH 7.4）中，于30℃条件下，测定各组线粒体悬液加入不同浓度氯化钙后5 min时吸光度的减少值，以此吸光度的减少值作为衡量线粒体肿胀程度的指标，比较各组线粒体诱发相同肿胀程度所需Ca2+浓度，诱发同等程度的肿胀所需的Ca2+浓度越高，表明该线粒体敏感性越低，说明损伤越严重［8，9］。
       2.7  统计方法
       进行单因素方差分析（one way analysis of variance, one way ANOVA），各处理组的组间差异采用SNK-q（Student Newman Keuls-q）检验进行比较。显著性水平取a=0.05。
       3  结果
       3.1  LSE对DGalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤酶活力的影响由图1可看出，DGalN/LPS损伤小鼠的sAST及sALT活性急剧升高（P<0.01），而预先以不同剂量LSE灌胃给药的小鼠sAST及sALT活性均显著低于损伤组（P<0.01），其中200，400 mg·kg-1 LSE组小鼠sAST及sALT活性已恢复至正常，表明LSE对DGalN/LPS诱发的急性肝损伤有明显对抗作用。
       3.2  LSE对DGalN/LPS急性肝损伤小鼠肝细胞超微结构的影响观察图2发现，正常小鼠肝细胞线粒体具有完整双层膜结构，线粒体排列整齐有序，细胞核核质分布均匀。DGalN/LPS损伤组中小鼠肝细胞发生明显的凋亡形态学变化，细胞核固缩，出现脂滴沉积，线粒体结构破坏。而200 mg·kg-1LSE组小鼠肝细胞的细胞核结构均有所改善，脂滴数也逐渐减少，尤其是400 mg·kg-1LSE处理组，细胞核形态、线粒体排列等与正常组的小鼠肝组织形态结构无明显差异。
       3.3  LSE对DGalN/LPS急性肝损伤小鼠肝脏线粒体膜电位的影响  各处理组小鼠肝脏线粒体的膜电位值见图3。正常小鼠的线粒体膜电位值为-（190.2 ± 5.9） mV ，DGalN/LPS损伤后小鼠肝脏线粒体膜电位值下降为-（162.4 ± 8.1）mV (14.6 %, P<0.01)。而预先以各剂量LSE处理的小鼠肝脏线粒体膜电位的值则有所回升。200，400 mg·kg-1LSE组小鼠肝脏线粒体的膜电位值与正常小鼠无差异，即完全对抗了DGalN/LPS诱导的线粒体膜电位的降低。
       3.4  LSE对DGalN/LPS损伤小鼠肝脏线粒体肿胀敏感性的影响由图4可知，正常组小鼠肝脏线粒体在50 mmol·L-1Ca2+诱发下产生明显肿胀，其吸光度下降值为230.0，小鼠急性肝损伤后，诱发与正常组小鼠线粒体相同程度的肿胀所需Ca2+浓度达302.0 mmol·L-1，为正常组Ca2+浓度的6.0倍，(P<0.01），预先给予100，200，400 mg·kg-1 LSE；LSE灌胃处理的小鼠肝脏线粒体诱发相同程度肿胀所需Ca2+的浓度与损伤组相比有所减少，表明LSE可一定程度抑制损伤引起的肝脏线粒体敏感性下降，表明LSE对DGalN/LPS引起的线粒体肿
       4  讨论
       DGalN/LPS肝损伤是筛选护肝药、研究药物作用原理最常用的免疫性肝损伤模型，其病理变化以细胞凋亡为主要特征［10］。
       本研究发现，LSE能显著抑制DGalN/LPS引起的肝损伤小鼠血清ALT和AST活力的升高，表明LSE具有明显对抗肝损伤的作用。小鼠肝细胞超微结构的变化的观察进一步证明了LSE的对抗肝损伤作用，其中，LSE可明显改善损伤引起的细胞核固缩等典型凋亡形态学变化这一结果，提示其保护作用与抑制肝细胞凋亡有关。
       越来越多的证据表明，在细胞凋亡或坏死过程中，线粒体起着关键作用。许多疾病发生过程中均伴随着线粒体功能的改变，而线粒体功能缺陷可导致人类和动物多种疾病的发生。最新研究已经证实，在肝损伤过程中伴随着线粒体功能的改变，而某些护肝药物可以通过保护肝脏线粒体、抑制细胞凋亡，从而发挥肝脏保护作用［11，12，7］。因此，本研究以肝脏线粒体为靶点，考察LSE对肝损伤小鼠肝脏线粒体的影响，以深入探讨LSE的护肝机制。
       线粒体膜电位的存在对于线粒体乃至整个细胞正常功能的维持十分必要。线粒体为一双层膜围成的囊状结构，外膜通透性较大，允许多种物质通过，内膜通透性相对较低，内膜上存在一些载体蛋白或通道以便运输某些物质。质子泵存在于内膜，它将基质内质子泵入外室，从而形成横跨内膜的线粒体膜电位。大量证据表明，在线粒体损伤过程中伴有膜电位的下降，维持线粒体膜电位则可阻止凋亡的进展。研究发现，在几乎所有诱导剂引起的各种类型的细胞凋亡中，均出现线粒体膜电位的下降，而膜电位的异常会严重影响线粒体功能。本研究检测线粒体膜电位的值发现，DGalN/LPS能引起小鼠肝细胞线粒体膜电位一定程度下降，这与前面［13，7］的研究结果相吻合，而一定剂量LSE可完全逆转了肝损伤引起的肝脏线粒体膜电位的下降，表明LSE对肝脏线粒体起显著保护作用。
       体外高钙诱导线粒体肿胀模型可用于线粒体活性的检测。在体外高钙浓度条件下，Ca2＋通过线粒体膜上的uniporter进入线粒体，与线粒体内膜上高通透性转运孔道蛋白上的Ca2＋特异性位点饱和结合，可触发一系列过程从而诱发线粒体肿胀。运用以上模型，以诱发线粒体产生肿胀所需Ca2＋的浓度为指标，可比较线粒体的不同活性状态［8，9］。本研究比较正常、肝损伤及预先用LSE灌胃处理的小鼠肝脏线粒体发现，正常小鼠线粒体对高钙敏感，外加 50 mmol·L-1Ca2＋即产生明显肿胀；而急性损伤小鼠肝脏线粒体需加6.0倍的Ca2＋才能诱发相同程度的肿胀，表明小鼠肝脏线粒体对高钙诱发肿胀的敏感性因肝损伤而有明显下降。预先给予LSE灌胃处理的小鼠肝脏线粒体诱发相同程度肿胀所需要的Ca2＋浓度与肝损伤小鼠相比有不同程度回升，提示LSE可一定程度维持对钙诱发肿胀的敏感性。以上结果进一步证实了LSE对肝细胞的保护作用与其肝脏线粒体保护作用密切相关。
       综上所述，本研究探讨了LSE的护肝作用及机制，发现，LSE 可显著对抗DGalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤，其药理机制可能与其保护线粒体、抑制细胞凋亡有关。
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