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       【摘要】 
       目的研究竹节参总皂苷（TSPJ）对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞增殖的影响。方法酶消化法进行胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞的原代培养，MTT法检测TSPJ对滑膜细胞增殖的影响，流式细胞仪检测TSPJ对滑膜细胞凋亡率的影响。结果TSPJ可明显抑制体外培养的CIA大鼠滑膜细胞的增殖，TSPJ可诱导滑膜细胞凋亡。结论TSPJ可有效抑制体外培养的胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞的增殖，这可能是其治疗类风湿关节炎的机制。
       【关键词】  竹节参总皂苷 类风湿关节炎 滑膜细胞 细胞凋亡
       Inhibitory Effect of Total Saponins of Panax japonicus on the Proliferation of Synoviocytes in Collagen-induced Arthritis Rats
       YUAN Ding，DUN Yaoyan，ZHANG Changcheng
       (Medical College of China Three Gorges University, Yichang 443002, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of total Saponins of Panax japonicus on the proliferation and apoptosis of synoviocytes in collagen-induced arthritis rats in vitro.MethodsPrimary synoviocytes were cultured by enzymatic digestion. Synoviocytes were incubated with various concentrations of total saponins of Panax japonicus for 48 hours. Synoviocytes proliferation was determined by MTT colorimetric assay. The apoptosis rate of synovial cells was examined by flow cytometer.ResultsTotal saponins of Panax japonicus had marked dose-dependent inhibitory effects on synovial cell proliferation. Apoptosis rate was inereased with the elevation of concentration of total saponins of Panax japonicus.ConclusionThe results of this study suggest that the total saponins of Panax japonicus has remarkable suppressive effects on proliferation of synoviocytes of CIA rats in vitro. This may be the mechanism of RA treatment.
       Key words:Total saponins of Panax japonicus（TSPJ）；  Rheumatoid arthritis；  Synoviocytes；  Apoptosis
       类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎为主要特征的自身免疫性疾病,其关节滑膜细胞功能的改变直接影响病理进程。在多种炎性因子的刺激下,关节滑膜细胞肿瘤样无限增生,对关节软骨、骨造成进行性破坏,最终导致关节畸形和功能障碍。因此，对关节滑膜细胞的保护在治疗中具有重要意义。竹节参Rhizoma of Panax japonicus系五加科人参属植物竹节参的干燥呈竹鞭状根茎，民间常用其治疗病后虚弱、风湿痹证、筋骨疼痛、虚损劳伤等疾患［1］。研究表明竹节参主要活性成分为皂苷类［2］。本实验研究竹节参总皂苷体外对胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠滑膜细胞增殖的影响，并检测滑膜细胞凋亡率的变化，来探讨竹节参总皂苷对类风湿关节炎的可能作用。
       1  材料
       1.1  药物
       竹节参采于湖北省宜昌五峰山区，经鉴定为五加科人参属植物竹节参的根茎，洗净，晒干，打成粗粉。
       1.2  动物
       清洁级雄性Wistar大鼠，体重110～125g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，许可证SCXK（鄂）2004-0007。
       1.3  试剂
       牛Ⅱ型胶原，Chondrex公司产品；不完全弗氏佐剂和EDTA为Sigma公司产品；胰蛋白酶，Difco公司进口分装；Ⅰ型胶原酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT ) 及二甲基亚矾(DMSO)均为Amresco 公司产品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品；PRMI-1640培养基和Vybrant Apoptosis Assay Kit #4 为Invitrogen公司产品。
       2  方法
       2.1  药物制备
        
       竹节参药材粗粉经75%乙醇回流提取浓缩后用水饱和的正丁醇萃取，再浓缩干燥后加水溶解后上D101大孔吸附树脂，水洗，10%乙醇洗，然后收集70%乙醇洗溶液部分，浓缩后干燥即得竹节参总皂苷粉末。用RPMI-1640培养液稀释竹节参总皂苷至所需浓度，0.22 μm的微孔滤器除菌分装，4℃保存备用。
       2.2  大鼠CIA模型的制备［3］
       将一定量的Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L的冰醋酸（Ⅱ型胶原浓度为2 mg/ml），在4℃下搅拌充分溶解，置4℃冰箱过夜。将Ⅱ型胶原溶液滴加至冷的不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund"s adjuvant, IFA )中，将二者等体积混合，充分乳化，制成CⅡ乳剂。置4℃冰箱保存备用。每只大鼠分5点皮内注射0.5 mlⅡ型胶原溶液（背部4点、尾根部1点），每点0.1 ml。7 d后，同样方法再加强注射1次。
       2.3  滑膜细胞的分离与培养［4，5］
       模型制备21～35 d后，大鼠脱臼处死，置于75％酒精浸泡2 min，膝关节局部酒精消毒于膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，可见平滑光亮的滑膜组织，用手术剪分离关节囊的滑膜层和纤维层，然后取出滑膜层组织。用同法采集另一侧膝关节滑膜层组织。将取得的滑膜组织用含青、链霉素的D-Hanks液浸泡后，经D-Hanks 液和RPMI-1640培养液漂洗后将滑膜组织剪碎成小块，然后加入含Ⅰ型胶原酶的RPMI-1640培养消化。待消化6～8 h后离心，加RPMI-1640培养液吹打混匀细胞沉淀，置于培养箱中培养。次日去掉未贴壁的细胞。3～5 d更换1次培养液。待滑膜细胞铺满瓶底后，EDTA-胰酶消化传代，取3～5代细胞用于实验。
       2.4  MTT法检测TSPJ对滑膜细胞增殖抑制的影响
       滑膜细胞用胰酶消化后，调整细胞浓度为7×104/ml。实验设阴性对照组和用药组，共分9组，每组设6复孔，将滑膜细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μl。另用100 μl培养液作空白对照。37℃, 5%CO2条件下培养48 h后，1～8组分别加入已配好的不同浓度的TSPJ溶液（2.5，5，10，20，40，80，160，320 μg/ml），每孔100 μl。第9组只加10%小牛血清的RPMI-1640培养液不加药，为阴性对照组。37℃,5%CO2条件下继续培养48 h后，加入浓度为5 mg/ml的MTT，每孔20 μl。继续培养4 h后小心吸弃培养孔中的上清液，加入二甲基亚矾（DMSO），每孔150 μl。室温下振荡10 min，酶联免疫检测仪492 nm波长测定各孔吸光度即OD值，以每组6个孔的均值作为结果。计算抑制率。
       
       抑制率（%）=〔对照组吸光值-加药组吸光值〕对照组吸光值-空白组吸光值×100%
       2.5  流式细胞仪检测细胞凋亡率
       滑膜细胞消化、离心、重悬，制成细胞密度为1×106/ml的细胞悬液，接种于培养瓶内，37℃，5%CO2培养箱内培养48 h后加不同浓度的竹节参总皂苷（50，100，200 μg/ml）继续培养48 h后用EDTA-胰蛋白酶消化滑膜细胞，PBS重悬细胞，离心1～2次，弃上清，加1 mlPBS混悬细胞，从离心管中转入流式专用管。每毫升细胞悬液加染料1μl。各管加染料后冰上避光染色30 min后上机检测。
       2.6  统计学处理
       实验数据均使用SPSS10.0软件进行统计学分析。数据采用±s表示,组间差异用单因素方差分析,多个样本均数间每两个均数的比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。
       3  结果
       3.1  TSPJ对滑膜细胞的抑制率 结果见表1。
       3.2  流式细胞仪检测细胞凋亡率结果细胞经YO-PRO-1（以下简称YP）/PI染色后,正常活细胞表现为YP－/PI－,在荧光视野下不可见；凋亡细胞表现为YP＋/PI－，细胞核被染为绿色；坏死细胞表现为YP－/PI＋和极少量的YP＋/PI＋，细胞核被染为红色。各给药组与阴性对照组相比，有显著性差异；低浓度组与中浓度组相比，P＜0.05，余组间相比，P＜0.01，故各给药组间均有显著性差异。结果见表2。表1  各组OD值及抑制率(略)表2  各组细胞凋亡率(略)
       4  讨论
       类风湿关节炎是一种以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性自身免疫病，病理特征主要表现为关节滑膜过度增生。目前认为关节的损害主要是由于滑膜细胞的活化和增生引起的，而滑膜细胞凋亡的相对不足可能与滑膜细胞过度增生有关。因此，抑制滑膜细胞的增殖已成为研究治疗RA的新靶点。前人的研究显示，竹节参可用于治疗类风湿关节炎，而我们的前期实验也证实竹节参总皂苷可以治疗佐剂性关节炎，但具体作用机制尚不明确。采用体外滑膜细胞培养技术有助于探讨RA发病机制以及体外药物筛选。本实验结果显示竹节参总皂苷可显著抑制CIA大鼠滑膜细胞增殖，可见竹节参总皂苷是竹节参的有效活性成分，并且竹节参总皂苷可以通过作用于滑膜细胞而发挥治疗作用。流式细胞仪检测结果显示，给药各组细胞凋亡率与阴性对照组相比有显著差异，说明竹节参总皂苷可以诱导滑膜细胞凋亡。
         
       本实验通过体外培养的CIA大鼠滑膜细胞，研究了竹节参总皂苷对RA的可能作用靶点，结果初步证实竹节参总皂苷对滑膜细胞存在显著的增殖抑制作用，并可诱导滑膜细胞凋亡。由于本实验研究的是大鼠的滑膜细胞，与人类的RA滑膜细胞存在着种属的差异，而且体外培养细胞与体内的环境有很大的差别，不能将体外培养的结果简单的等同于细胞在体内的实际情况，因此还需要做体内实验以进一步证实实验结论。竹节参总皂苷可能在RA的治疗中起到一定作用，但其具体作用机制尚不明确，还需要进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会. 中国药典, Ⅰ部［S］. 北京：化学工业出版社，2005：93.
       
       ［2］常新金, 丁丽霞. 中药活性成分分析手册(上)［M］.北京：学苑出版社, 2002：886.
       
       ［3］徐叔云，卞如濂，陈 修. 药理实验方法学，第3版［M］.北京：人民卫生出版社, 2001：921.
       
       ［4］王斌，陈敏珠，徐叔云. 大鼠滑膜细胞的分离和培养［J］.中国药理学通报, 1994, 10(1)：73.
       
       ［5］Miqita K, Tanaka F, Yamasaki S, et al. Regulation of rheumatoid synoviocyte proliferation by endogenous p53 induction［J］.Clin Exp Immunol，2001，126(2)：334.