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       【摘要】 
       目的研究消癥煎膏对大鼠子宫肌瘤以及子宫肌瘤中TGF-β3的影响。方法造模大鼠60只，随机分成5组，每组12只：实验组消癥煎膏分高、中、低3个剂量组，直肠给药；中桂组，予桂枝茯苓胶囊溶液灌服，每次0.5 ml/kg；模型组。另设空白组12只，每天灌服0.9%生理盐水，0.5 ml/kg/次，以上各组均给药3次/d，共4周。停药后第1天内处死大鼠，立即取标本实验研究。结果治疗组大鼠子宫重量明显减轻，宫颈和宫体处最大直径显著缩小，与模型组比治疗组子宫系数降低明显；实验组3个剂量的TGF-β3水平与模型组比较P<0.05，有显著意义；中桂组与模型组比较，P<0.05；模型组与空白组比较，P<0.01，有非常显著意义。结论消癥煎膏能使子宫肌瘤缩小，明显降低TGF-β3表达，抑制子宫肌瘤细胞增殖，使肌瘤缩小，因此推测其内可能含有TGF-β抗体类物质在起作用。
       【关键词】  消癥煎膏 直肠给药 子宫肌瘤 转化生长因子-β3
       子宫肌瘤（UL）是女性生殖系统最常见的良性肿瘤，主要由子宫平滑肌细胞增生而成，其间有少量纤维结缔组织［1］。分子生物学研究显示UL的发生与众多生长因子及细胞因子有关，这些因子以自分泌或旁分泌方式促进子宫平滑肌细胞增殖，形成一个复杂的因子网络，在UL中这些生长因子源于平滑肌细胞，又作用于平滑肌细胞促进其增殖。在子宫肌瘤培养细胞中分别加入相等质量浓度的TGF-β1与TGF-β3,结果均发现培养细胞中纤维结合蛋白mRNA的水平上升,而加入TGF-β3上升更明显。Arici等［2］也研究证实在子宫肌瘤和肌层细胞中加入TGF中和抗体1型和3型胶原蛋白mRNA显著下降。因此，抗TGF物质可以抑制子宫肌瘤生长，TGF-β抗体是一种可能用于治疗子宫肌瘤的新药。中医中药在降低生长因子、细胞因子表达方面有着非常明显的效果。如何寻找一种更为有效的中草药，抑制或降低UL中生长因子的表达，正是本实验的主要目的。
       1  器材
       1.1  对象两个月龄左右雌性大鼠Sprague Dawley(SD)品系(以下简称大鼠)。动物由广西医科大学实验动物中心提供，符合健康一级动物标准。合格证号：桂检证字0771-20060911。
       1.2  药物及试剂消癥煎膏，广西中医药研究所研究所提供，批号20061028；苯甲酸雌二醇注射液（2 mg/ml）,上海通用药业股份有限公司产品，批号20051102；黄体酮注射液（20 mg/ml）,上海通用药业股份有限公司产品,批号050901。桂枝茯苓胶囊(0.31 g/粒)，江苏康缘药业股份有限公司产品，批号200609；兔抗人多克隆TGF-β3及SABC即用型试剂盒均购自上海蓝创生物科技发展有限公司产品，批号050102。
       1.3  仪器石蜡切片机（英国），Olympus 生物显微照相系统（日本），Siemens DME2冰箱（德国），Cmias-2000真彩色病理图像分析系统软件(北京麦克奥迪公司)，电子秤 JD1000-2(沈阳龙腾电子称量有限公司)。
       2  方法
       2.1  复制大鼠UL模型本实验参照文献［3，4］的实验方法，综合其优点造模。购回大鼠86只，体重180～220 g，适应性饲养1周。随机抽出14只作空白对照组, 不加任何干预因素,颗粒麦麸喂养；其余大鼠进行造模，每只肌注苯甲酸雌二醇0.12 mg/0.06 ml，3次/周；每只肌注黄体酮1 mg/ 0.05 ml，1次/周；共15周。造模过程中模型组大鼠死亡2只（第51天死亡1只，第68天死亡1只），分析原因可能为：人为摔伤致死。尸检示：子宫直径稍增大，血管数量增多并且增粗充盈，尚未见肌瘤形成。 第15周最后1天，从造模组中随机抽取大鼠10只,对照组2只, 称重，断头处死,剖腹观察子宫形态，测量宫颈、宫体最大直径，称子宫重量，计算子宫系数(子宫重mg/g体重)，然后用10%福尔马林溶液固定，取其最大横切面，石蜡包埋切片，HE染色，Olympus显微镜下测子宫壁肌层情况。
       
       成瘤的判断标准［5］：子宫肌细胞显著增生，体积增大，排列密集;核体积增大，核仁肥大，见少数畸形核;细胞内含有丰富的有致密小体的肌微丝，线粒体肥大增生，数目增加，嵴模糊，粗面内质网扩张，游离核糖体增多;细胞周围可见大量增生、紊乱、排列不规则的胶原纤维。
       本实验造模病理切片及大体标本图片如下图：正常大鼠子宫组织切片见图1（HE染色×200），模型大鼠UL组织见图2（HE染色×200）；模型鼠与空白组大鼠子宫各项指标以及造模抽样结果见表1。
       2.2  分组及给药方法把造模成瘤的60只大鼠，随机分成5组，每组12只：消癥煎膏高、中、低3个剂量组（分别简称中高组、中中组、中低组）、模型空白对照组（简称模型组）、桂枝茯苓胶囊组（简称中桂组）；另设空白对照组（简称空白组）亦12只，每组动物体重无显著性差异。
       
       给药方法：给药前轻按摩大鼠肛门,促其排便,以小棉栓沾消癥煎膏纳入肛门约0.5 cm处。如发现有药栓排出,及时补上，给药期间称体重1次/周，随时调整给药剂量。共给药4周，停药后第1天内处死大鼠，处死当天不给药。中高组按1.632 ml/（kg·d）(相当于成人用量30倍)；中中组按0.816 ml /（kg·d）(相当于成人用量20倍)；中低组：按0.40 ml/kg·d(相当于成人用量10倍)，均直肠给药，3次/d。中桂组予桂枝茯苓胶囊溶液灌服，0.5 ml/（kg·d）/次，3次/d。模型组以及空白组：每天灌服0.9%生理盐水，0.5 ml/次，3次/d。
       2.3  检测项目
       2.3.1  一般观察实验期间要注意观察大鼠的精神状态、皮毛的色泽、状态，饮食、体重、粪便、发情周期、对外界刺激的反应能力以及活动休息时的情况：休息的姿势、眼裂大小、黏膜色泽等，做出与用药前的对比分析。表1  模型鼠与空白组大鼠子宫各项指标以及造模抽样结果(略)
       2.3.2  大鼠TGF-β3的测定将切除的新鲜肌瘤及部分正常子宫肌组织用10%甲醛液固定4～8 h,继而制备蜡块，5 μm切片，免疫组织化学染色, 兔抗人多克隆TGF-β3及SABC即用型试剂盒，按试剂盒说明书严格操作。
       
       操作流程：脱蜡、水化——PBS洗两次各5 min——用PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭10 min，蒸馏水洗3次——抗原修复——PBS洗5 min——滴加10%正常羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体——滴加Ⅰ抗, 37℃1 h（4℃过夜后再37℃复温45 min）——PBS洗3次，2 min/次——滴加生物素化二抗，20～37℃，20 min——PBC洗3次，2 min/次——滴加试剂SABC，20～37℃，20 min-PBS洗4次，5 min/次：自配显色剂显色（为了方便镜下掌握显色程度——蒸馏水洗,苏木素复染2 min，盐酸酒精分化——100%乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。
       2.4  结果判定 
       用组织评分(II-score)法［6］，以胞浆或胞膜出现着色为阳性标记。i代表染色深浅，共0～3分：0分，未出现染色；1分，胞浆胞膜呈淡红色或红褐色；2分，红色；3分，深红色或红黑色。Pi代表每一着色程度的细胞所占比例，为（0～100）%。H-score=∑Pi(i+1)，满分为4分。每个切片选择4个视野，每个视野测定3次后取平均值，由同一人使用同一台仪器测定。
       2.5  统计学处理所有结果采用SPSS11.5软件包进行处理，用±s进行描述，组间及组内比较采用单因素方差分析里面的多重组间比较。
       3  结果
       3.1  一般观察结果造模期间大鼠精神状态欠佳，皮毛色泽稍干涩，毛易脱落，饮食比造模前有减少，对外界刺激呈防守状态，攻击性强，休息时易惊，粪便一般较黏稠，偶有少许淡红色分泌物附着，味腥臭。体重增加约40～65 g。
       
       实验后，大鼠精神状态逐步好转，皮毛色泽稍光滑，毛发脱落有改善，饮食增加，对外界刺激呈防守状态，攻击性减低，休息时易惊状态好转，粪便正常。体重增加约10～23 g。各组实验大鼠子宫各项指标情况见表2。表2  消癥煎膏对实验大鼠子宫各项指标的影响 (略)
       实验组大鼠子宫系数(%)、宫颈最大直径、宫体最大直径与模型组比较有显著意义，说明消癥栓能使UL缩小，有治疗UL作用。
       3.2  大鼠TGF-β3的测定结果用药前各组大鼠切片图形及TGF-β3表达情况：大鼠正常子宫组织切片见图3（HE染色×200），大鼠UL组织见图4（HE染色×200），TGF-β3表达见图5（免疫组织化学染色×200）。
       研究表明，实验结果显示实验组3个剂量均能降低UL中的TGF-β3水平，说明消癥煎膏中可能含有拮抗TGF-β3表达的中药成分。实验组3个剂量的TGF-β3水平与模型组比较P＜0.05，有显著意义；中桂组与模型组比较P＜0.05；模型组与空白组比较，P＜0.01，有非常显著意义；3个实验组与中桂组比较P＞0.05，差异无显著性。消癥煎膏干预后（用药后）各组的组织切片图形TGF-β3表达情况：大鼠空白对照组见图6（HE染色×200），各组的组织切片图形TGF-β3表达情况见图7～11（均采用免疫组织化学染色×200）。TGF-β3在子宫肌瘤瘤边、肌瘤中心、子宫肌层中的表达情况分别见表3和图12。
       
       4  讨论
       4.1  直肠给药的依据汉代医学家张仲景，首创了世界上最早的肛门煎膏剂和灌肠术的外治法。用蜂蜜炼制“蜜煎导”煎膏和猪胆汁、土瓜根等导入肛门治疗便秘等病。现代医家利用该法治疗多种疾病：黄同德等［7］用清热解毒、活血化瘀、软坚散结类中药灌肠治疗84例慢性盆腔炎，痊愈68例,显效11例,好转3例,无效2例,其中1例不能坚持治疗，治愈率:80.9%，有效率:94%。对照组:用青霉素钠320万单位加甲硝唑注射液0.2静滴,治疗57例患者痊愈14例,显效4例,好转3例，无效36例，治愈率:24.6%，有效率:31.6%。治疗组明显优于对照组。祝晓波［8］则用自拟中药灌肠治疗放射性直肠炎56例，治愈5例,显效43例,有效8例,显效率85.71%。以上资料均表明直肠给药不失为一种有效的治疗手段，尤其是直肠给药在治疗妇科疾病方面有一定的特色与优势。表3  TGF-β3在瘤边、肌瘤中心、子宫肌层中的表达情况(略)
       放射性同位素研究报道，不经肝脏而吸收的药物，据相应的给药部位计算，为总给药量的50％～75％。宫歧顺认为：药物的吸收与其给药部位有关。认为在大鼠直肠0.5cm处放置栓剂，发现有75％的物质吸收入体循环，25%入门脉，而在占大鼠直肠长约2/3处，则证明各有50％的物质进入体循环和门脉［9］。发现经肛门给药比口服和注射刺激小、疗效好、作用快，不仅是治疗肛门直肠局部病变好方法，而且是全身给药的一个比口服和注射有更多优点的途径。因直肠粘膜没有角质层，药物透入较容易、速度快，但此处皮肤较为娇嫩，不耐刺激，用药要求高。所以给药时要注意操作仔细、用药足量、尽量避免不必要的重复操作；为防止药物被排出，选择小棉栓沾药纳入直肠，尽可能的使用药时间与用药剂量达到实验标准，减少外因对实验结果的影响。
       4.2  消癥煎膏直肠给药对子宫肌瘤模型鼠TGF-β3的作用TGF-β超家族成员TGF-β3在子宫肌瘤组织中的表达有明显意义。1992年Nelson推测在肌瘤生长中EGF和TGF，可能是一对互补因子，但是TGF作用可能更加重要，E2可以使大鼠子宫TGF的mRNA表达增加，而且是EGF的30倍。研究表明，抗TGF物质可以抑制子宫肌瘤生长，TGF-β抗体是一种可能用于治疗子宫肌瘤的新药。TGF-β抗体与TGF-β结合，通过抑制肌瘤组织纤维化及细胞外基质的沉积，可能达到治疗子宫肌瘤的目的。
       
       本实验制剂消癥煎膏为活血化瘀、消癥散结类中药，研究发现消癥煎膏能明显降低TGF-β3表达，抑制子宫肌瘤细胞增殖，使肌瘤缩小，因此推测其内可能含有TGF-β抗体类物质在起作用。
       【参考文献】
         　　［1］乐 杰.妇产科学，第6版［M］.北京：人民卫生出版社，2005：295.
       
       ［2］Arici A, Sozen I. Transforming growth factor-3 is expressed at high levels in leiomyoma where it stimulaters fibronectin expression and cell prolixferation［J］.Fertil Streil,2000,73(5)：1006.
       
       ［3］胡舒勤，郑红兵.桂枝茯苓胶囊对实验性子宫肌瘤中孕激素和胰岛素样生长因子I的影响［J］.湖北中医杂志，2005，27（4）：6.
       
       ［4］李冬华.子宫肌瘤大鼠模型制备方法之比较［J］.中国现代医学杂志，2005，15（24）：3700.
       
       ［5］白会敏，王惠兰，陈素琴. 转化生长因子β1，β3及其受体βRＩ，βRⅡ，mRNA及蛋白在子宫肌瘤组织中的表达［J］.河北医科大学学报，2003，24(3)：155.
       
       ［6］Murphy AA,Kettel LM,Morales AL,et al.Endometrial effects of long term adminstr- iosis［J］.Fertil Steril,1995,63(4):761.
       
       ［7］黄同德，周贵枝.中药灌肠液治疗慢性盆腔炎84例［J］.中国医院药学杂志，2005，25（12）:1159.
       
       ［8］祝晓波.中药灌肠治疗放射性直肠炎109例［J］.浙江中西医结合杂志，2006，16(8）：5213.
       
       ［9］吴眉平，舒洪权，赵 琼.直肠栓剂的进展［J］.中国肛肠杂志，2000，20(7）：32.