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       【摘要】 
       目的研究转基因何首乌毛状根中的化学成分。方法采用硅胶、Sephadex LH-20、ODS柱色谱等方法分离何首乌毛状根中的化学成分，并根据理化性质和波谱数据鉴定其化学结构。结果从何首乌毛状根60％乙醇提取物中分离得到了12个化合物。利用理化性质及波谱技术确定其结构分别为：2, 3, 5, 4"-四羟基反式二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(1)、没食子酸(2)、没食子酸甲酯(3)、3, 5-二羟基苯甲酸(4)、丁香酸(5)、对羟基苯甲酸(6)、胡萝卜苷(7)、β -谷甾醇(8)、豆甾醇(9)、烟酸(10)、碳直链十七酸(11)、碳直链三十一酸(12)。结论上述12个化合物均为首次从转基因何首乌毛状根中分离得到；化合物3，4，5，6为首次从该种植物中分离得到。
       【关键词】  何首乌 毛状根 化学成分
       Studies on the Chemical Constituents from Hairy Roots of Polygonum multiflorum Thunb.
       YAN Chunyan, MA Na, WANG Jinlin, YU Rongmin
       1．College of Pharmacology, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 
       2. College of Pharmacology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
       Abstract：ObjectiveTo study the chemical constituents from the transgenic hairy roots of Polygonum multiflorum Thunb..MethodsThe compounds I-XII were isolated by a combination of silica gel, Sephadex LH-20, and ODS chromatographic technologies and their structures were identified by spectral methods.  ResultsTwelve known compounds were isolated from hairy roots of P. multiflorum. Their structures were identified by means of spectroscopic analysis as: 2,3,5,4"- tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside (1), gallic acid (2), methyl gallate(3), 3,5-dihydroxybenzoic acid(4), 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoic acid(5), p-hydroxybenzoic acid(6), daucosterol (7), β-sitosterol(8), stigmasterol(9), nicotinic aicd(10), n-CH3(CH2)15COOH(11), n-CH3(CH2)29COOH(12).  ConclusionAll compounds are isolated firstly from transgenic hairy roots of P. multiflorum and compounds 3～6 are isolated from P. multiflorum for the first time.
       Key words：Polygonium multiflorum；  Hairy roots；  Chemical constituents
       何首乌，又名首乌、赤首乌，为蓼科植物何首乌Polygonum multiforum Thunb.的干燥块根。其性微温、气微、味微苦而甘涩，有解毒、消疮痈、润肠通便等功能，可用于肝肾精血亏虚、头昏目眩、须发早白等病症的治疗［1］。何首乌的化学成分主要为蒽醌类、二苯乙烯苷类、酚酸类以及卵磷脂等化合物类型［2］。
       
       自20世纪80年代以来，基因工程的研究成果渗透到细胞工程中来，引起了细胞培养研究的新突破。其中通过发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)中Ri质粒介导的天然植物遗传转化，建立发根培养系统来生产原植物中的次生代谢产物成为植物基因工程和细胞工程相结合的一项新技术。转基因毛状根（transgenic hairy roots）能够在无激素的培养基上生长，并且其生长速度大大高于其相应的细胞培养物和未转化的根培养物［3］，具遗传性状稳定、次生代谢产物含量高等优点［4］。本实验在前期工作基础上，对转基因何首乌毛状根进行了较系统的化学成分研究，从中分离得到12个单体。本文报道其分离和鉴定工作。
       1  仪器与材料
       熔点用北京泰克仪器有限公司X-4数显显微熔点测定仪测定；NMR用VARIAN INOVA-400型核磁共振仪测定。所用溶剂为工业级试剂经过重蒸处理；Sephadex LH-20为瑞士安玛西亚公司产品；RP-18为美国默克公司产品；柱层析硅胶和薄层层析硅胶(GF254)均为青岛海洋化工厂产品。
       何首乌毛状根由本室诱导获得。PCR和Southern杂交表明发根农杆菌Ri质粒中的T-DNA已经整合到何首乌细胞核的基因组中［3］。
       2  方法与结果
       2.1  提取与分离何首乌毛状根450 g (DW)，粉碎后经60％乙醇加热回流提取5次， 2 h/次。减压浓缩得浸膏。浸膏用水分散，依次以石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩醋酸乙酯和正丁醇萃取液分别得到浸膏A（50 g）和浸膏B（10 g）。浸膏A用300～400目的硅胶柱分离，以氯仿-甲醇梯度洗脱。氯仿-甲醇(90：10)洗脱部分，经Sephadex LH-20柱分离，得化合物8，9，11和12；氯仿-甲醇(85：15)洗脱部分，经Sephadex LH-20柱分离，ODS纯化得化合物2，3和7；氯仿-甲醇(80：20)洗脱部分，经RP-18纯化得化合物1。浸膏B用200～300目的硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇(4: 1)洗脱，再经反复Sephadex LH-20和ODS柱纯化，得化合物1，2，4，5， 6和10。
       2.2  结构鉴定
       2.2.1  化合物1 
       白色无定形粉末(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，乙醇。IR (KBr) cm-1：3 420, 1 606, 1 515。ESI-MS: 407［M+H］ +，379［M-CH2=CH2 + H］ +；1H-NMR ［400 MHz，CD4O］ δ: 3.3-3.8 (6H，m，糖上H)，4.54 (1H，d，J=8.0  Hz，H-1"")，6.28 (1H，d，J=2.4 Hz，H-4)，6.58 (1H，d，J=2.4 Hz，H-6)，6.80 (2H，d，J=8.0 Hz，H-3", 5")，6.96 (1H，d，J=16.0 Hz，H-2a)，7.49 (2H，d，J=8.0Hz，H-2", 6")，7.75 (1H，d，J=16.0 Hz，H-1a)；13C-NMR［100 MHz，CD4O］δ: 158.3 (C-4")，155.9 (C-5)，152.0 (C-3)，137.9 (C-2)，133.6 (C-1")，130.8 (C-2a)，130.0 (C-2", 6")，129.2 (C-1a)，121.6 (C-1)，116.4 (C-3", 5")，108.2 (C-6)，103.5 (C-1"")，102.6 (C-4)，78.1 (C-5"")，77.9 (C-3"")，75.4 (C-2"")，70.6 (C-4"")，62.7 (C-6"")。以上数据和文献［2］对比基本一致。故确定化合物1为2, 3, 5, 4"-四羟基反式二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2, 3, 5, 4"-te- trahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside)。
       2.2.2  化合物2 
       淡棕色针状结晶(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，乙醇。mp 235～238℃，FeCl3反应阳性。IR(KBr) cm-1：3 434, 1 715, 1 629, 1 363, 1 092；ESI-MS: 171 ［M+H］+，169 ［M-H］-；1H-NMR ［400 MHz, CD4O］ δ: 4.76 (3H，s，3 × ArOH)，7.09 (2H，br s，2 × Ar-H)；13C-NMR ［100 MHz，CD4O］δ: 170.5 (C=O)，146.3 (C-3, 5)，139.6 (C-4)，121.8 (C-1)，l10.3 (C-2, 6)。以上光谱数据与文献［5，6］基本一致，故将化合物2鉴定为没食子酸(gallic acid)。
       2.2.3  化合物3 
       白色固体粉末(氯仿-甲醇)。IR (KBr) cm-1：3 362, 1 693, 1 536, 1 330, 1 263, 1 213, 765；ESI-MS: 185 ［M+H］+；1H-NMR ［400 MHz, CD4O］δ: 3.85 (3H, s, COOCH3), 7.08 (2H, s, H-2, 6)；13C-NMR［100 MHz，CD4O］ δ: 169.2 (C=O)，146.5 (C-3, 5)，139.8 (C-4)，121.3 (C-1)，109.9 (C-2, 6)，52.3 (OCH3)。以上数据与文献［6，7］基本一致，故鉴定该化合物为没食子酸甲酯（methyl gallate)。
       2.2.4  化合物4 
       白色结晶性粉末(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，乙醇。mp 235～237℃。FeCl3反应阳性。IR (KBr) cm-1：3 442, 1 682, 1 610, 1 482, 1 402, 917, 851, 766；ESI-MS: 155 ［M+H］+；1H-NMR ［400 MHz，CD4O］δ: 6.49 (1H，t，J=2.4 Hz，H-4)，6.97 (2H，d，J=2.4 Hz，H-2, 6)；13C-NMR ［100 MHz，CD4O］δ: 170.0 (C=O)，159.7 (C-3, 5)，133.7 (C-1)，119.0(C-2, 6)，108.1 (C-4)。根据以上光谱数据鉴定该化合物为3, 5-二羟基苯甲酸(3, 5-dihydroxybenzoic acid)。
       2.2.5  化合物5 
       白色针晶(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇。mp 212～213℃，FeCl3反应呈阳性。IR (KBr) cm-1：3 383, 1 699, 1 619, 1 522, 1 460, 1 373, 1 205, 1 114, 865；ESI-MS: 197 ［M-H］-; 1H-NMR ［400 MHz，CD4O］δ: 3.93 (6H，s，OCH3 × 2)，7.37 (2H，s，H-2, 6)；13C-NMR ［100 MHz，CD4O］δ: 169.9 (COOH)，148.8 (C-3, 5)，141.7 (C-4)，121.9 (C-1)，108.3 (C-2, 6)，56.8 (OCH3×2)。以上光谱数据与文献［8，9］基本一致，故化合物5鉴定为丁香酸(syringic acid)。
       2.2.6  化合物6 
       白色针状结晶(氯仿-甲醇)，易溶于甲醇，FeCl3反应呈阳性。IR (KBr) cm-1: 3 396, 2 924, 2 651, 2 543, 1 673, 1 608, 1 594, 1 510, 1 448, 1 424, 1 320, 1 244, 1 169；ESI-MS: 139 ［M+H］+；1H-NMR ［400 MHz，CD4O］δ: 6.85 (2H，dd，J=7.2, 2.4Hz，H-3, 5)，7.9l (2H，dd，J=7.2, 2.4Hz，H-2,6)；13C-NMR［100 MHz，CD4O］δ: 170.1 (C=O)，163.4 (C-4)，133.0 (C-2, 6)，122.7 (C-1)，116.0 (C-3, 5)。以上光谱数据与文献［10，11］基本一致，化合物6鉴定为对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)。
       2.2.7  化合物7
       白色无定型粉末(甲醇)，难溶于氯仿、丙酮，微溶于甲醇，易溶于吡啶。mp 282～284℃。254 nm下无紫外吸收，与10%硫酸乙醇溶液反应显紫红色，与磷钼酸反应显蓝色，初步推断化合物为萜类或甾体化合物。TLC结果显示Rf值与胡萝卜苷标准品一致。且混合后熔点不下降，故将该化合物鉴定为胡萝卜苷(daucosterol)。
       2.2.8  化合物8
       白色片状结晶。1H-NMR［400 MHz，CDCl3］ δ: 0.68 (3H，s，H-18)，0.80 (3H, t，J=8.0 Hz，H-29)，0.85 (6H, d, J=7.2 Hz，H-26, 27)，0.92 (3H, d，J=7.2Hz，H-21)，1.01 (3H，s，H-19)，3.52 (1H, m, H-3)，5.36 (1H, m, H-6)。以上光谱数据与β-谷甾醇文献值［12］基本一致，故将其鉴定为β-谷甾醇(β-sitosterol)。
       2.2.9  化合物9 
       白色片状结晶。1H-NMR ［400 MHz，CDCl3］δ: 0.79 (3H，s，H-18)，0.80 (3H, t，J=8.0 Hz，H-29)，0.87, 0.83 (3H, each，br s，H-26, 27)，1.04 (3H，s，H-19)，1.05 (3H，br s， H-21)，5.03 (1H, dd, J=8.5Hz，15.0 Hz，H-23)，5.15 (1H，dd，J=8.5，15.0 Hz，H-22)，5.36 (1H，br d，J=4.4 Hz，H-6)。根据以上光谱数据与文献［13］对照，鉴定该化合物为豆甾醇(stigmasterol)。
       2.2.10  化合物10
       白色针晶。mp 234～237℃。ESI-MS: 124［M+H］ +，80 ［M-CO2 +H］＋；1H-NMR ［400 MHz，DMSO-d6］δ: 7.55 (1H，dd，J = 8.0, 4.8 Hz，H-5)，7.78 (1H，d，J = 4.8 Hz，H-6)，8.26 (1H, d, J = 8.0 Hz，H-4)，9.072 (1H, br s，H-2)；13C-NMR ［100 MHz，DMSO-d6］δ: 166.5 (COOH)，153.5 (C-2)，150.4 (C-6)，137.2 (C-4)，126.8 (C-3)，124.0 (C-5)。以上光谱数据与文献［8］基本一致, 该化合物鉴定为烟酸(nicotinic aicd)。
       2.2.11  化合物11
       白色固体粉末，易溶于氯仿。ESI-MS: 269 ［M-H］-；1H-NMR ［400 MHz，CDCl3］δ: 0.88 (3H, t, J=6.8 Hz, CH3)，2.38 (2H, t，J=7.6Hz, α-CH2)。化合物鉴定为碳直链十七酸。分子式为：n-CH3(CH2)15COOH。
       2.2.12  化合物12 
       白色固体粉末，易溶于氯仿。ESI-MS: 465 ［M-H］-；1H-NMR ［400 MHz，CDCl3］δ: 0.88 (3H，t，J=6.8Hz，CH3)，2.38 (2H，t，J=7.6Hz，α-CH2)。综合以上数据，将化合物12鉴定为碳直链三十一酸。分子式为：n-CH3(CH2)29COOH。
       3  讨论
       本研究组对何首乌毛状根中的蒽醌类成分已有报道。本实验在前期工作基础上对其进行了较系统的化学成分研究。从中分离到12个单体，均为首次从转基因何首乌毛状根中分离得到；其中化合物3，4，5，6为首次从该种植物中分离得到。
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