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       【摘要】 
       目的揭示川乌煎煮时间、给药剂量与毒性的相关性。方法采用均匀设计的方法，将川乌分别煎煮15 min，30 min，1 ，2 ，3 ，4 ，6 h，生药含量依次为临床用量的6，12，24，48，72，96，120倍。模型对照组和各给药组于复制痹证动物模型后，按组给药30 d。观测动物生长发育、血液学、血液生化学、脏器系数、病理组织学变化及停药15 d后上述指标的变化。将结果进行多元回归分析，得出川乌煎煮时间、剂量与毒性的相关性。结果川乌水煎液能抑制痹证动物的足跖肿胀；对模型动物的生长发育无明显影响；对其造血系统无明显毒性；对其肝脏、肾脏、心脏有一定毒性。川乌水煎液毒性最大的煎煮时间和给药剂量是30 min,120倍。结论煎煮30 min，给药剂量为临床用量120倍时，川乌水煎液对痹证动物产生的毒性最大，但药效最佳。
       【关键词】  川乌 煎煮时间 给药剂量 毒性 均匀设计
       Correlation Study between Decocting Time, Administration Dosage and Toxicity of Radix Aconiti
       LIU Yao，PENG Cheng
       1.Guangdong Traditional Chinese Medical Institute，Guangzhou 510520, China；
       2. Chengdu University of TCM, Chengdu 610075, China
       Abstract：ObjectiveTo study the correlation between decocting time (DT),administration dosage(AD) and the toxicity of Radix Aconiti(RA).MethodsAccording to uniform designed technology, RA was decocted with different duration of 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours and 6 hours,and the content of RA was 6 times, 12 times, 24 times, 48 times, 72 times, 96 times, 120 times of clinic AD respectively. All rats except normal control group were made up BiZheng animal model, and administered RA decocted liquids for 30 days. The changes of hematology, blood biochemistry,organ coefficient, histopathology test index were detected before and after 15 days. The regression analysis was adopted to study the relativity between DT, AD and the toxicity of RA.Results RA decocted liquids could decrease voix pedis tumefaction of BiZheng model animals, but had no effect on the growth and development  and hematopoietic system of model animals. They had certain toxicity to livers, kidneys, and hearts of the model animal.The DT and AD of maximal toxicity of RA decocted liquids were 30 minutes and 120 times.Conclusion RA decocted liquids with DT 30 min and AD 120 times have the maximal toxicity and the best medicinal effect.
       Key words：Radix Aconiti(RA);  Dectocting time (DT);  Administration dosage(AD);  Toxicity;  Uniform Design
       川乌为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的干燥母根。始载于《神农本草经》，列为下品。其味苦、辛，大热，有大毒，功能祛风除湿、温经散寒、行淤止痛［1］。研究表明川乌具有良好的镇痛、抗炎和免疫抑制作用，但因其毒性大，临床上常因用药不当而造成中毒甚至死亡［2～5］。目前，川乌的毒理学实验研究较少，已报道的川乌长期毒性实验中，均采用正常健康动物［6］，对病证模型动物的毒性研究目前未见。煎煮时间与给药剂量是影响川乌毒性的重要因素。其煎煮时间，临床报道从15 min～6 h不等，也有以口尝不麻为度；给药剂量，临床应用从1.5～60 g不等。因此实验根据临床实际应用和前期完成的急毒实验情况，设定了7个煎煮时间点和给药剂量，并引入均匀设计法，研究不同煎煮时间，给药剂量的川乌水煎液对痹证动物模型的长期毒性的影响。
       1  材料与仪器
       1.1  药物川乌，购自四川江油，经成都中医药大学中药鉴定教研室鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的干燥母根。参见《中国药典》2000年版制剂通则项，以3倍量水浸泡30 min，加至10倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮沸后15 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h等7个时间点，煎煮完毕减压浓缩为每毫升含原生药1g。根据均匀设计表U＊7(74)，川乌煎煮15 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h 7个时间点分别取临床剂量［3g·（60 kg）-1·d-1］的72倍，12倍，120倍，48倍，6倍，96倍和24倍。实验时用蒸馏水配制成适当浓度的药液。造模药物为完全弗氏佐剂（美国Sigma公司产品）。
       1.2  动物
       SPF大鼠180只，雄性，体重130～160 g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，合格证号：川实动管质SCXK(川)2004－12号。
       1.3  仪器与试剂
       电子天平；KX－21N型电子血球自动计数仪（日本Sysmex公司）；TMS1024i型全自动血液生化分析仪（日本东京贸易株式会社）；光学显微镜（日本奥林巴斯仪器公司），游标卡尺，YT-100电子压痛仪等。Urea，Crea，TP，ALB，ALT，AST，ALP检测试剂盒（上海申能－德赛诊断技术有限公司生产，生产批号依次为：310/021/1，171/014/1，231/021/01，022/018/03，4609/23262/01，4704/23872/02，5406/26835/1）；TC，TG检测试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司生产，生产批号依次为：200506，200502）；TBIL，GLU检测试剂盒（四川美辰生物科技有限公司生产，生产批号依次为：0504，0506）；TT检测试剂盒 （ROCHE公司生产，生产批号050186）。
       1.4  实验设施
       SPF（specific pathogen free condition）实验动物屏障系统，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，使用许可号：第05-50号。
       2  方法
       2.1   动物分组与造模及给药健康合格的SPF大鼠180只，全雄，随机分为9组，即空白对照组、模型对照组、生川乌15 min水煎液组、30 min水煎液组、1 h水煎液组、2 h水煎液组、3 h水煎液组、4 h水煎液组和6 h水煎液组，每组20只。模型对照组和各给药组于大鼠右足足跖处注射完全弗氏佐剂0.1 ml/只。从造模当天开始，各组每日于9 ～11 AM按大鼠体重10 ml·kg-1·d-1分别灌喂蒸馏水、不同煎煮时间点的生川乌水煎液，共30 d。
       2.2  检测指标
       2.2.1  一般状态观察观察动物造模及给药期间的一般行为活动和精神状况，每周记测1次体重；测量大鼠足肿胀度：分别于造模前、造模后0.5h,18h，第2天至第10天上午8时用游标卡尺法测定各组大鼠右足肿胀度，第11天至第30天上午8时测定各组大鼠左、右足肿胀度。
       2.2.2  血液学及血生化学检测末次给药24 h后，每组随机取12只大鼠，股静脉采血，作WBC，RBC，Hb，HCT，MCV，MCH，MCHC，PLT，Ret计数检测，以及GLU，UREA，CREA，TP，ALB，ALT，AST，TBIL，TC，TG以及电解质Na，K，Cl离子的测定。
       2.2.3  系统剖检与脏器系数及组织病理学检测脱颈椎法处死动物，进行系统剖解。称其脏器湿重并计算脏器系数。
       组织病理学检测：①取动物心、肝、脾、肺、肾、脑、甲状腺、胸腺、肾上腺、胰腺、脊髓、食管、气管、胃、小肠、大肠、睾丸、附睾、前列腺组织各一块，立即投入10%甲醛液内固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察。②痹证关节病理组织观察：取左、右踝关节，采用10%中性甲醛溶液固定，24 h后用混合脱钙液加温脱钙48 h，常规进行石蜡包埋，切片（5 μm），HE染色，光镜下观察。
       2.3  可逆性观察剩余动物作一般状态观察，每周记测1次体重。15 d后处死，进行系统剖检，称取脏器湿重，计算脏器系数，组织病理学检查，血液学及血液生化学检测，指标和方法同前。
       2.4  统计学方法  数据资料先用SPSS统计软件单因素方差分析进行统计学处理，再用均匀设计软件进行多元回归分析。
       3  结果
       3.1  川乌水煎液给药30 d一般状态观察受试动物用药期间，一般行为活动正常，对刺激反应灵敏，无呆滞、嗜睡，无躁动、震颤，无流涎、流涕，饮水、摄食正常，粪便质地无异常，会阴部无污秽。各组体重无明显差异。   
       3.2  川乌水煎液给药30 d大鼠足跖肿胀度各给药组大鼠右后足（致炎侧）于造模后18 h至第2天，足跖和踝关节明显红肿，局部皮温增高，肿胀度达到峰值，持续2 d后逐渐减轻，第21天左右又出现一次肿胀高峰。第11天，与空白对照组比较，给药组大鼠左足有明显肿胀。给药期间，各给药组大鼠的左、右足肿胀度较模型组有不同程度的减轻（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。药效发挥最佳的煎煮时间和给药剂量集中在30 min,120倍。部分足肿胀度测定数据见表1～2。表1  川乌水煎液给药30天对大鼠右足足跖肿胀度的影响（略）表2  川乌水煎液给药30 d大鼠左足足跖肿胀度的影响（略）
       
       表1回归分析：第5天肿胀度回归方程：Y＝0.611＋3.10×10－3X1－5.42×10－5 X1 X2＋1.86×10－5 X22 －1.44×10－7 X23(最优条件：煎煮时间30 min，给药剂量120倍)；第13天肿胀度回归方程：Y＝0.613＋1.74×10－3X1＋1.15×10－5 X2－4.54×10－5 X1X2 －8.14X22(最优条件：煎煮时间30 min，给药剂量120倍)；第21天肿胀度回归方程：Y＝0.632＋2.94×10－4 X1X2－5.07×10－6 X12X2－2.91X22 X1(最优条件：煎煮时间30 min，给药剂量120倍)；第26天肿胀度回归方程：Y＝0.562＋1.21×10－2X1＋9.94×10－4 X2－2.87×10－4X12－1.30×10－4 X1X2－4.90×10－8 X23(最优条件：煎煮时间30 min，给药剂量120倍)；第30天肿胀度回归方程：Y＝0.596＋1.35×10－3X1＋1.16×10－4 X2－2.96×10－7 X1X2(最优条件：煎煮时间30 min，给药剂量120倍)。
       表2回归分析：第13天左足肿胀度回归方程：Y＝0.386＋1.26×10－3X2－8.98×10－6 X22－5.18×10－7 X22X1（最优条件：煎煮时间30 min，给药剂量120倍）；第17天肿胀度回归方程：Y＝0.366－8.34×10－4X1＋3.27×10－4 X2＋9.03×10－5X2X1－1.18×10－6 X22 X1－1.51×10－8 X23（最优条件：煎煮时间30 min，给药剂量120倍）；第27天肿胀度回归方程：Y＝0.325＋1.24×10－3X2－7.79×10－6 X12－2.28×10－5 X22＋1.08×10－7 X23（最优条件：煎煮时间30 min，给药剂量104.2倍）。
       3.3  川乌水煎液给药30 d大鼠血液学、血液生化学检测各组大鼠血液学各项指标均在正常范围内。血液生化学指标中，除2 h组外的其余各给药组Crea值较空白对照组显著增高。对异常指标进行多元回归分析：Crea值回归方程：Y＝45.7＋3.45X1－0.162X2－8.92×10－2X12＋1.88×10－3X22－1.09×10－3X12X2。结果显示毒性最大的煎煮时间与给药剂量是30 min，120倍。部分血液生化学检测数据见表3。表3  川乌水煎液给药30 d对大鼠血液生化学的影响（略）
       3.4  川乌水煎液给药30 d脏器系数、病理组织学检查1 h组肾脏脏器系数明显高于空白对照组，肾脏器系数回归方程Y＝6.78－5.1×10－2X1＋1.04×10－2X2＋5.7×10－3X1X2－7.93×10－5X22X1,结果显示毒性最大的煎煮时间与给药剂量是30 min，38.15倍。部分脏器系数检测数据见表4。表4  川乌水煎液给药30 d对大鼠脏器系数的影响（略）
       
       病理组织学检查结果：15 min组有1例心脏局灶性炎症；30 min组有1例肝脂肪样变；15 min组有2例肾脏局灶性炎症。模型组有7例踝关节软组织充血、水肿。
       3.5  生川乌水煎液停药可逆性观察受试动物停药期间，生长发育正常，一般行为和一般状态正常，各组间体重无明显差异。3 h组Urea值较空白组有明显升高，Urea值的回归方程：Y＝10.5－0.536X1－6.91×10－2X2＋1.3×10－2X12＋3.53×10－4X22＋5.11×10－5 X1X22，结果显示毒性最大的时间与剂量是30 min，120倍。6 h组肾脏和15 min组脑的脏器系数较空白组明显升高。肾脏器系数回归方程：Y＝7.28＋1.44×10－2X12－1.64×10－3X1X2－4.59×10－4X13。脑脏器系数回归方程：Y＝5.38＋4.65×10－2X1＋2.21×10－2X2－1.47×10－3X12－4.04×10－4X22＋2.08×10－6X23。结果显示，毒性最大的煎煮时间与给药剂量分别是20.55 min，6倍和15.85 min，120倍。病理组织学检查结果显示，各给药组动物的组织器官均为正常，模型组有4例踝关节软组织有慢性炎症及纤维组织增生。部分血液生化学指标测定数据见表5。表5  生川乌水煎液停药15 d对大鼠血液生化学的影响（略）
       4  讨论
       当前，药物长期毒性实验的实验动物一般选用健康动物。由于乌头类有毒中药的安全性研究中大量实验已证明，乌头类中药水煎液对疾病模型动物产生的毒性效应与健康动物有差异（杨  卓.《附子煎煮时间、给药剂量与毒性的相关性研究》.成都中医药大学2002级硕士学位论文）。结合病证动物模型研究川乌的毒性将对临床用药更具指导意义，因此我们选用佐剂性关节炎模型大鼠作为研究川乌长期毒性的实验对象，揭示生川乌水煎液煎煮时间和给药剂量与毒性的相关性。
       由于影响中药毒性的因素多元化，故本课题引入了数学的方法——均匀设计。其特点为每因素的每水平只作一次实验，实验次数等于水平数。应用均匀设计法得出的实验结果与正交设计并无显著性差异，仍能反映体系的主要特征，因此特别适合多因素、多水平的实验研究［7］。本课题选择影响生川乌水煎液毒性的两个主要因素——煎煮时间和给药剂量，每个因素选择7个水平，共进行7次实验，将实验结果多元回归分析，得出煎煮30 min，给药剂量为临床用量120倍时，对痹证动物的毒性最大同时药效最佳。该结果仅是应用统计方法得出的一个理论推测值，对于该结果的真实性、可靠性、重复性还要通过重复实验得到验证。
       本课题研究结果表明川乌水煎液的毒性作用对痹证模型大鼠病理组织学和血液生化学的影响较小。其长期毒性是否有可能体现在对神经系统或心血管循环系统功能的损害，或对机体其他组织功能的改变，还有待进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］田代华.实用中药辞典,第1版［M］.北京:人民卫生出版社，2002:177.
       
       ［2］师海波,周重楚,李延忠，等.川乌总碱的抗炎作用［J］.中国中药杂志,1990,15(3):46.
       
       ［3］宋东江,陆满文，李汉青.乌头碱类化合物毒理学研究概况［J］.中国药理学通报,1989,5(5):272.
       
       ［4］王浴生.中药药理与应用,第2版［M］.北京:人民卫生出版社，1998:109.
       
       ［5］何忠文,何平文.附子川乌草乌中毒12例辨析［J］.江西中医学院学报,2000,12(2):54.
       
       ［6］万德光,彭 成,赵军宁.四川道地中药材志［M］.成都:四川科学技术出版社，2005:80.
       
       ［7］方开泰.均匀设计－数论方法在试验设计中的应用［J］.应用数学学报,1980,3(4):363.