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       【摘要】 
       目的建立红车轴草总异黄酮粉剂中总异黄酮含量的测定方法，从而对该品进行质量控制。方法采用紫外分光光度法直接测定粉剂中总异黄酮含量，测定波长为250 nm。结果回归方程为：Y＝0.131 2 X＋0.009 5，相关系数r＝0.999 7，平均回收率为98.3%，RSD为2.06%，线性范围为1.004 0～5.020 0 mg/ml。结论紫外分光光度法测定该粉剂中总异黄酮含量结果准确、方便、快捷、重现性好。
       【关键词】  紫外分光光度法 红车轴草粉剂 总异黄酮
       Study on the Determination of the Content of Isoflavones in Trifolium pratense Fenji
       ZHU Xiansen，  HUANG Zhiqin， YANG Qingchun，CHENG Qilai
       Department of Pathology，Gannan Medical College, Ganzhou,341000,China
       Abstract：ObjectiveTo establish the determination method of content of isoflavones in Trifolium pratense Fenji by UV spectromertry and control the quality. MethodsThe content of isoflavones was determined by measuring the UV absorbance at 250nm..ResultsThe linear relationship was y=0.131 2x+0.009 5,r=0.999 7 , the recovery was 98.3% , RSD=2.06%;the linear range was 1.004 0～5.020 0 mg/ml. ConclusionIt is specific，accurate，convenient and rapid for measuring the content of isoflavones.
       Key words：UV spectromertry;  Trifolium pratense Fenji;  Isoflavones;  Determination of Concentration
       
       中药红车轴草Trifolium pratense L.为豆科车轴草属多年生草本植物的干燥花序及带花枝叶,又名红三叶红花苜蓿三叶草等［1］，在我国大部分地区均有生产，主要含有蛋白质、氨基酸、糖类、维生素和异黄酮等成分，其中异黄酮具有抗肿瘤（胃癌、乳腺癌）和治疗骨质疏松、更年期综合征［2］、抑制前列腺癌和骨髓白血病细胞的生长、改善动脉血管的柔顺性［3］等多种功能。随着对研究的深入，目前国内外科学家已从红车轴草中发现了四十多种异黄酮类化合物，主要是大豆黄素、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A等及其相应的苷类。目前关于红车轴草及其提取物中异黄酮报道较少，大多只测定了刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A。红车轴草总异黄酮粉剂由中药材红车轴草经现代制药工艺提取、浓缩、干燥、粉碎而成。本文对该粉剂中总异黄酮的含量测定进行了相关研究。
       1  仪器与试药
       紫外可见分光光度计： UV2450PC（日本岛津公司）；红车轴药材购自广东清远药材市场，红车轴草总异黄酮粉剂由实验室自制，芒柄花素对照品由中国药品生物制品检定所提供。甲醇（色谱纯），水（重蒸水），其他试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  样品的制备取红车轴草药材，粉碎成粗粉，加85%甲醇浸泡2 h后回流提取两次，2 h/次。将提取液吸入减压浓缩罐中，减压回收至相对密度1.05～1.10（50℃）。浓缩液冷却后静置分层，倾出上层药液，下层沉淀待处理；上层药液加5倍量水，搅拌30 min后离心处理。离心后所得沉淀与上述浓缩液下层沉淀合并，加6倍量溶剂于室温下脱脂3次，每次搅拌30 min后静置1 h，吸除上层溶剂，下层脱脂沉淀物60℃真空干燥后用醋酸乙酯乙醇混合溶剂加热回流提取2 h，冷至室温后滤过，滤液减压浓缩至所加混合溶剂体积的1/12，冷至室温后再静置8 h，滤过，沉淀物60℃真空干燥，粉碎，将样品用甲醇配成适当浓度溶液即得。
       2.2  测定方法的选择根据化学成分研究结果，红车轴草含有黄酮类成分、蛋白质、糖类、脂溶性色素和少量的甾醇类等成分，本品经纯化后，主要含芒柄花素、鹰嘴豆芽素A等异黄酮类化合物及少量的脂溶性色素成分。这些异黄酮类化合物在紫外区具有很强的特征吸收，因此选择紫外分光光度法测定本品总黄酮的含量。
       2.3  对照品的选择根据化学成分研究结果，芒柄花素（formononetin）是本品含量最高的成分，因此选择芒柄花素作为本品含量测定的对照品。
       2.4  测定波长的选择将样品和芒柄花素对照品用甲醇配成适当浓度，在200～400 nm范围内扫描，两者最大吸收波长均在250 nm ，因此选择250 nm作为本品的测定波长。
       2.5  线性关系和回归方程精密称取芒柄花素对照品10 mg，置10 ml量瓶中，加适量的甲醇溶解并稀释至刻度。精密吸取该溶液0.5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得每毫升含0.05 mg的芒柄花素对照品溶液。准确吸取芒柄花素对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，以甲醇为空白对照，于250 nm波长处测定吸收值。以吸收度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。其线性关系和回归方程为：Y＝0.131 2 X＋0.009 5，相关系数r＝0.999 7，线性范围为1.004 0～5.020 0 mg/ml。
       2.6  提取溶剂的选择粉剂中所含的异黄酮类成分在甲醇、乙醇、丙酮等溶剂中均有较好的溶解度，因此我们对甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、丙酮和50%丙酮进行了考察。
       
       具体方法为：精密称取样品5份，每份50 mg，分别置于100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、丙酮和50%丙酮各50 ml，密塞，称定重量，超声处理20 min，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液1 ml，置10 ml量瓶中，于水浴上挥干溶剂，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取该溶液0.5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇为空白对照，于250 nm波长处测定吸收度，计算总异黄酮含量。结果表明甲醇提取的含量测定值最高，故选择甲醇为含量测定时的提取溶剂。
       2.7  提取方法的选择含量测定中，常用的提取方法有回流提取法、索氏提取器提取法和超声提取法。以甲醇为溶剂，对这3种提取方法进行了考察。结果表明超声提取效果最佳，因此选择超声提取。
       2.8  提取时间的选择以甲醇为溶剂，对超声提取法的提取时间进行考察。结果表明超声提取20 min以后，含量不再增加，因此选择提取时间为20 min。
       2.9  稳定性实验样品配制后分别在0，1，2，3，4，5，6h，测定吸收度，(见表1)。结果表明样品在6 h内稳定。表1  稳定性实验结果（略）
       2.10  精密度实验取同一批号样品的供试品溶液，连续测定5次（见表2）。结果表明仪器精密度良好。表2  精密度实验结果（略）
       2.11  重现性实验精密称取同一批号的样品5份，测定吸光度（结果见表3）。结果表明样品测定重现性好。表3  重现性实验结果（略）
       2.12  加样回收实验精密称取样品5 mg（总异黄酮的含量为604.8 mg/g），置25 ml三角瓶中，加芒柄花素对照品溶液3.0 ml（浓度为1.004 mg/ml），充分吸附后，置水浴上蒸发至干，再精密加入甲醇10 ml，称定重量，测定吸光度，计算回收率（结果见表4）。平均回收率为98.3%。表4  加样回收实验结果（略）
       2.13  4批中试产品的测定精密称取供试品适量，配成供试品溶液。照拟定的测定方法测定，同法做空白实验，照分光光度法［4］，在250 nm处测定吸收度，计算，即得。结果见表5。表5  4批中试产品中总异黄酮的含量测定（略）
       根据测定结果，暂定本品每克含总异黄酮以芒柄花素（C16H12O4）计，不得少于550 mg。
       3  讨论
       对总异黄酮提取工艺进行了初步研究，结果表明超声提取，用甲醇作提取溶剂，提取时间为20 min，结果较理想。
       紫外分光光度法测定该粉剂中总异黄酮含量结果稳定、方便、快捷，可为其他剂型总异黄酮含量测定提供方法借鉴。
       【参考文献】
         　　［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版,1977:1012.
       
       ［2］曾虹燕,周朴华,侯团章.红车轴草有效成分的研究进展［J］.中草药，2001,32(2):189.
       
       ［3］Rice L,Samedi V G,Medrano T A,et al.Mechanisms of the growth inhihitoty effects of the isoflavonoid biochanin A on LNCap cells and xenografts［J］.The prostate,2002,52:201.
       
       ［4］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005:附录ⅤA.