文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨槲皮素治疗胃癌细胞的作用机制。方法采用不同浓度的槲皮素处理胃癌 BGC823 细胞后，采用四唑盐比色试验检测癌细胞生长，分别以琼脂糖凝胶电泳和 TUNEL 检测癌细胞凋亡，分别采用荧光实时定量 PCR 和 Western blot 检测存活素（survivin）基因mRNA、蛋白表达情况。结果槲皮素抑制胃癌 BGC823 细胞的恶性增殖，且呈浓度依赖性；琼脂糖凝胶电泳和 TUNEL显示，槲皮素处理组出现凋亡现象，且呈浓度依赖性。槲皮素处理组 survivin 基因 mRNA、蛋白表达下调，且呈时间和浓度依赖性。结论槲皮素体外能抑制胃癌细胞的恶性增殖，与诱导凋亡、下调 survivin 基因表达有关。
       【关键词】  胃肿瘤 槲皮素 细胞凋亡 存活素
       Study of Quercetin on Proliferation of Gatric Cancer Cell Line BGC823
       XU Yongzhong, FAN Yu, YAO Guangtao, LI Yikui
       1.Department of Chemical Analysis,Affiliated Hospital,Jiangsu University,Jiangsu Zhenjiang 212001,China;
       2.Experimental Center of Science and Technology of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203,China
       Abstract：ObjectiveTo identify the inhibitory effects and mechanism of Quercetin on gastric cancer.MethodsGastric cancer BGC823 cells were treated with different doses of quercetin,and the  growth of cancer cell was exmined by MTT assay,and the apoptosis were determined by agarose gel electrophoresis and TUNEL assays,respectively.The real time-PCR and western blot were performed to study the expression of survivin.ResultsQuercetin had a remarkable inhibition on gastric cancer cell line BGC823.From DNA ladder and TUNEL assay,apoptosis were induced in cancer cells treaed with quercetin,in a dose- dependent manner.In addition, quercetin resulted in down-regulation of survivin mRNA and protein from real time-PCR and western blot assay.ConclusionQuercetin can inhibit the growth of human gastric cancer BGC823 cell through inducing apoptosis and down-regulating survivin gene in vitro.
       Key words：Gastric cancer;  Quercetin;  Apoptosis;  Survivin
       胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发现时一般已经处于中晚期，目前尚缺乏有效的治疗手段，故寻找有效的治疗药物和治疗手段是当务之急。槲皮素(quercetin)是一种天然的黄酮类化合物，广泛分布于蔬菜、水果及常见中草药之中。已有研究发现，槲皮素可抑制多种肿瘤细胞的增殖［1，2］，是颇具应用前景的抗癌药物之一，但内在机制尚不清楚，且目前尚无对胃癌细胞作用的报道。
       1  材料与方法
       1.1  材料
        
       槲皮素，购自 Sigma 公司，用 DMSO (二甲基亚砜)配成储液，-20℃冰箱保存。实验时用 1640 培养基稀释，DMSO 的最终浓度小于 0.9%。人胃癌细胞株 BGC823 购自中科院上海细胞所细胞库。TriIzol 试剂购自 Invitrogen 公司。BCA 蛋白分析试剂盒购自 PIERC E公司。细胞凋亡原位检测试剂盒，购自 Roche 公司。
       1.2  细胞培养及处理胃癌 BGC823 细胞在37℃，5% CO2 培养箱中培养，培养液为含 10% 小牛血清、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 RPMI-1640（美国GIBCO BRL）。待细胞至指数生长期，收集细胞，调整细胞浓度为1×104/ml，按每孔 0.1 ml 接种到 96 孔培养板中，24 h 后，分别加入不同浓度的槲皮素，设 3 个复孔，培养 48 h ，每孔加入 MTT 100 μl，作用 4 h 后，加入 DMSO100 μl，孵育 30 min ，在酶标仪 570 nm  处测吸光度A值，计算抑制率。
       1.3  细胞凋亡检测
       1.3.1  DNA末端原位标记染色法（TUNEL）接种胃癌细胞于 24 孔板，以不同浓度的槲皮素处理，48 h 后终止细胞培养，4% 多聚甲醛固定 30 min 。其余步骤按 Roche 公司药盒说明书进行。光镜下计算凋亡指数。凋亡指数（Apoptosis Index，AI）计算方法：数5个高倍镜＞1 000个细胞，分别计数总细胞数量和凋亡细胞数量。AI（%）＝凋亡细胞数/总细胞数×100％。
       1.3.2  琼脂糖凝胶电泳  
       按照文献［3］的方法进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下检测并拍照。
       1.4   Survivin基因表达检测
       1.4.1   mRNA 水平应用荧光实时定量 PCR 方法检测。以 Trizol 抽提细胞总 RNA，取总 RNA 1 μg，以 Oligo dT（15 mer）为引物逆转录合成cDNA第 1 链，以此 cDNA 链 2 μl 为模板进行 PCR 扩增，步骤参照说明书。引物序列为：上游：5"-ATTTGAATCGCGGGACCC-3"；下游：5"-GAGAAAGGGCTGCCAGGC-3"。FAM 探针：5"-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3"-TAMRA。以GAPDH为内参。定量 PCR 步骤和 PCR 反应条件参照文献［4］进行。
       1.4.2 蛋白水平采用
        
       Western blot 检测。按照上述时间对照组和各实验组细胞总蛋白，蛋白定量后进行常规检测。利用 Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software （Eastman Kodak Company，USA)测定Western blot条带净灰度值,并与内参照b-actin的测定结果相比较,计算其比值。
       1.5  统计分析 
       计数资料均经SPSS10.0统计软件收集、贮存和分析。
       2   结果
       2.1  槲皮素对胃癌细胞增殖的影响   
       采用 MTT 法检测槲皮素对胃癌细胞增殖的抑制作用，发现槲皮素可明显抑制胃癌 SGC823细胞的恶性增殖，且在5 ～40 μmol/L浓度范围内，呈明显的浓度依赖性。其IC50约为45.91 μmol/L。见图1。
       2.2  槲皮素诱导胃癌细胞 BGC823 凋亡 以不同浓度的槲皮素处理胃癌细胞后，收集细胞，分别采用琼脂糖凝胶电泳和 TUNEL 检测（见图2～3）。结果发现，处理组细胞凋亡指数明显增高，DNA凝胶电泳显现明显的梯状图谱，且均呈浓度依赖性（P＜0.05）。
       2.3  槲皮素对胃癌 BGC823 细胞 survivin 基因表达的影响 以槲皮素处理细胞后，于不同时间收集细胞，分别采用实时定量 PCR 和 western blot 检测。结果发现，与对照组比较，处理组mRNA和蛋白水平明显降低（P＜0.05）。结果见图4～5。
       3  讨论
       自1971年美国NCI组织首次发现槲皮素对 Ｐ388 白血病的抑制作用后，许多研究发现，槲皮素可抑制白血病、结肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等多种癌细胞的增殖，诱导肿瘤细胞发生凋亡［1］。但目前尚无槲皮素处理胃癌细胞的报道。本研究采用槲皮素处理胃癌 BGC823 细胞，观察了其对增殖的影响，并从端粒酶和细胞凋亡方面初步探索了其可能的机制。
       
       凋亡在调控细胞增殖、肿瘤的形成和发展中起关键作用［5］。本研究采用不同浓度的槲皮素处理胃癌细胞，于不同时间收集细胞，分别采用 TUNEL 和琼脂糖凝胶电泳检测发现，处理组细胞出现明显的凋亡现象，且时间和浓度呈依赖性。与此同时，胃癌细胞的恶性增殖受到抑制，并且与药物浓度相关。由此提示，胃癌细胞增殖被抑制，可能与诱导凋亡有关。
       经典的凋亡通路有两条，即死亡受体通路和线粒体通路。在这两条凋亡信号传导通路中，凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein,IAP）家族起抑制凋亡的作用［6］。Survivin 是IAP 家族的重要成员之一。研究发现，survivin 在分化成熟的细胞组织中很少表达，但在胚胎性组织及未分化完全的组织中高表达，在包括肺癌、乳腺癌在内的多种肿瘤组织中高表达［7］。在非小细胞肺癌、胃癌和神经母细胞瘤中，survivin 的高表达与肿瘤的抗药性增强和患者生存率降低有关［8，9］。研究发现［5］，survivin 在胃癌组织中高表达，而在癌旁组织中无表达。本研究以槲皮素处理胃癌细胞后，以荧光实时定量 PCR 方法和 Western blot 检测 survivin 基因 mRNA 和蛋白水平，发现处理组 survivin 蛋白和 mRNA 水平明显下调。另外，我们发现，survivin 表达水平降低的同时肿瘤细胞凋亡指数相应上升，经统计学分析，两者呈正相关（P＜0.01）。提示 survivin基因在槲皮素诱导胃癌细胞凋亡过程中起重要的作用。
       本研究提示，槲皮素体外可明显抑制胃癌细胞恶性增殖，其机制可能与诱导细胞凋亡和下调 survivin 基因表达有关。
       【参考文献】
         　　［1］Hollman P C, Kata M B. Dietary flavonoids: intake, health effects and bioavailability［J］. Food Chem Toxicol, 1999, 37 (9-10): 937.
       
       ［2］徐 标，韩春荣. 中草药活性成分抗肝纤维化作用及机理研究进展［J］.时珍国医国药,2006,17(1): 99.
       
       ［3］范 钰,郑 树,丁佳逸. 脂质体介导的cripto反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞端粒酶活性［J］. 中国病理生理杂志,2006,22 (4): 762.
       
       ［4］Fan Y, Zheng S, Xu ZF, et al. Apoptosis induction with polo-like kinase-1 antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide of colon cancer cell line SW480［J］. World J Gastroenterol,2005,11(29):4596.
       
       ［5］范 钰,林庚金,钱立平,等. 脂质体介导的c-myc反义硫代寡核苷酸诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡［J］.复旦学报·医学版,2002,29(1):26.
       
       ［6］范 钰,郑 树,赵 刚. RARb基因转染对胃癌细胞株MKN-45凋亡和存活素及半胱氨酸酶的影响［J］. 中国病理生理杂志,2005，21(12):2396.
       
       ［7］Kiechle FL, Zhang X. Apoptosis: biochemical aspects and clinical implications［J］. Clin Chim Acta,2002,326(1-2):27.
       
       ［8］Altieri DC. Validating survivin as a cancer therapeutic target［J］.Nat Rev Cancer,2003,3(1):46.
       
       ［9］Zaffaroni N, Pennati M, Daidone MG. Survivin as a target for new anticancer interventions［J］. J Cell Mol Med,2005,9(2):360.