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       【摘要】 
       目的观察姜黄素对大鼠子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)微血管密度(Microvessel density, MVD)的影响和抗血管形成作用。方法制作Wistar大鼠EMs动物模型。将大鼠分为正常组、假手术组、模型组、姜黄素低剂量组及姜黄素高剂量组5组，持续用药28 d，SP免疫组化法测定在位内膜和异位组织灶中 MVD 的表达。结果姜黄素治疗EMs模型大鼠4周后，异位组织中 MVD 的表达明显低于模型组，差异有显著意义(P＜0.05)，而在位内膜中 MVD 的表达与模型组相比，差异无显著意义(P＞0.05)；姜黄素可剂量依赖性的抑制EMs异位组织的增生(P＜0.05)。结论姜黄素对子宫内膜异位症大鼠异位组织中MVD的表达和新生血管形成均有抑制作用，作用呈剂量依赖性。姜黄素有望成为子宫内膜异位症抗血管形成治疗的新药。
       【关键词】  姜黄素 子宫内膜异位症 微血管密度 血管形成
       Inhibitory Effect of Curcumin on Microvessel Density in Ectopic Endometrium of Rats
       ZHANG Ying,CAO Hong,ZHANG Changjun
       1.The Affiliated People"s Hospital of Yunyang Medical College,Shiyan 442000,China;
       2.Hubei College of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430065, China
       Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Curcumin on microvessel density(MVD) and antiangiogenesis in ectopic endometrium of rats.MethodsEndometriosis model was established in wistar rats and the model rats were divided into the control group, sham operated group,model group,high-dose group and low-dose group after 4 weeks.MVD was observed in eutopic and ectopic endometrium by immunohistochemistry (SP technique) after 28 days treatment. ResultsMVD in ectopic endometrium decreased remarkably after treatment of curcumin after 4 weeks(P＜0.05),while the difference was no significant in the eutopic endometrium. Curcumin could significantly inhibit proliferation of ectopic endometrium in a dose-dependent manner. ConclusionCurcumin has inhibitory effect on the expression of MVD and angiogenesis in ectopic endometrium of rats, in a dose-dependent manner. Cuecumin maybe a new drug of antiangiogenesis in ectopic endometrium.
       Key words：Curcumin;  Endometriosis(EMs);   Microvessel density(MVD);  Angiogenesis
       子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）是妇科常见疾病之一，其发病率呈逐年增高的趋势。EMs为良性病变，但它的某些生物学行为却与恶性肿瘤类似，最显著的特征是具有组织侵袭和血管生成的能力。近年来大量研究表明血管生成是EMs发生发展的重要环节，抑制EMs 病灶局部血管生成就成为目前研究关注的热点之一。
       
       姜黄素(Curcumin)是从姜黄属中药莪术、姜黄、郁金等的块茎中提取的一种植物多酚，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种作用，近年研究发现它在体内外均可抑制多种肿瘤的生长。EMs 具有类似肿瘤的增生特点，但姜黄素是否对 EMs 有作用尚待研究。本实验以子宫内膜异位症模型大鼠作为实验对象，观察姜黄素对其异位内膜血管形成是否具有抑制作用。
       1  材料与方法
       1.1  动物清洁级雌性 Wistar 大鼠 56 只，鼠龄（60±5）d，体重（180±10）g，由郧阳医学院实验动物中心提供。
       1.2  材料姜黄素（分子式C21H20O6，分子量为368.4,纯度99%）购自Fluka公司。溶剂0.5%羧甲基纤维素钠溶液由湖北十堰市人民医院药剂科惠赠。微血管染色用兔抗鼠 CD31 多克隆抗体和 SP 免疫组化染色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。DAB 显色剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。OLYMPUS-CX21 普通光学显微镜。
       1.3  造模方法Wistar大鼠每日定时阴道脱落细胞涂片观察动情周期。选择连续有2个以上正常动情周期(阴道涂片为大量无核角化细胞)的大鼠，造模前一天每鼠肌注雌二醇［0.1 mg/(kg·d)］使动物统一处于动情期。
       1.3.1  EMs动物模型造模方法根据杨萍等［1］的方法制作 EMs 动物模型：10% 水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉，正中开腹，钝镊找到并分离出大鼠右侧子宫，结扎两端，剪下中间的一段子宫，迅速置于盛有生理盐水的弯盘中，沿系膜部位剪开管状子宫，切割成4 mm×4 mm大小的子宫片，注意区分内外膜。于腹壁切口两侧从腹肌与皮下筋膜层之间打一隧道，左右各一，分别将切割好的子宫片平整的置入两侧隧道底部，使内膜面紧贴腹肌，常规关腹。术后肌注青霉素预防感染。术后第2天开始肌注雌二醇［0.1mg/(kg·d)］，每隔4天1次，共3次，以促进异位内膜生长。术后每周触摸包块2次，观察包块有无及大小。4周后经病理学证实造模成功。
       1.3.2  假手术组造模方法手术条件及麻醉、开腹方法均同EMs模型组，开腹后分离并结扎右侧子宫两端，剪下中间的一段子宫丢弃。逐层缝合各层组织，术后应用青霉素预防感染。
       1.4  处理方法按上述方法造模
       36 只大鼠，造模后 4 周随机处死 6 只，病理学证实造模成功。再随机分为 3 组，每组10只，即模型组，姜黄素高剂量组［100 mg/(kg·d)］，姜黄素低剂量组［50 mg/(kg·d)］。姜黄素组将姜黄素分别用0.5% 羧甲基纤维素钠溶液配成混悬液灌服，模型组、正常组和假手术组各10只以等量0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌服。
       1.5 结果
       判断持续灌胃 28 d后，第29天处死，逐层打开腹腔，观察比较各组模型大鼠的异位内膜形态学变化。两脚规测量异位组织的体积(长×宽×高,单位mm3)。取下在位及异位内膜置于 10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，4 μm 厚度连续切片，进行HE染色和免疫组化染色。
       
       SP 法检测在位及异位内膜组织微血管密度(Microvessel density,MVD)，以细胞浆出现棕褐色颗粒为阳性细胞。以 CD31 多克隆抗体染色的单个内皮细胞或一簇内皮细胞作为一个微血管，不以红细胞和管腔的出现作为判断标准，有较厚肌层或纤维化或血管腔直径超过8个红细胞大小者均不计数。低倍镜下(100×)检视每张切片微血管染色分布，确定最高微血管染色区域，选择 5个最高微血管染色区域于高倍镜下(400×)分别进行微血管记数，计算平均数。
       1.6  统计学处理采用 SPSS12.0 软件分析数据，所有数据均以±s表示，组间差异比较采用双侧t检验。
       2  结果
       2.1  一般情况用药前后各组大鼠精神均可，活动正常，饮食及体重均无明显改变。
       2.2  异位内膜观察造模后约
        
       2 周可触摸到大鼠腹壁包块存在。处死时大体观可见模型组大鼠移植物生长良好，体积明显增大，呈隆起透亮的小囊状，内部充满积液，表面血管清晰可见；低倍镜下可见移植物已生长成一个或数个腔样结构，腔内面的上皮、固有膜及固有膜的基质细胞、腺体样结构都与正常组和假手术组大鼠的子宫相似；高倍镜下见上皮细胞低柱状，生长良好，个别部位有坏死及炎细胞浸润，固有膜厚度与成熟子宫相仿，其内有大量梭形的基质细胞，未见子宫腺体样结构存在及平滑肌组织，腔内有分泌物和炎细胞存在。姜黄素治疗后，低剂量组有4只移植物下积液没有完全吸收，异位子宫内膜无明显增生，腺体减少及间质狭窄。高剂量组有2只大鼠移植物下积液没有完全吸收，其余均可见扁平的萎缩成斑块状的移植物，异位子宫内膜腺体明显减少，腺腔变窄，细胞稀疏，分泌物少，成萎缩状态。
       
       用药治疗后，各组移植物体积明显小于治疗前(P＜0.05)；移植物体积缩小程度不同(P＜0.05)，以高剂量组效果为佳。结果见表1。表1  移植物体积比较（略）
       2.3  大鼠在位及异位内膜 MVD 计数模型组异位内膜的 MVD 要高于在位内膜；模型组在位内膜 MVD 较正常组和假手术组高，但无统计学意义(P＞0.05)；姜黄素治疗后低剂量组和高剂量组在位内膜的MVD均有下降，但与正常组相比均无明显差异(P＞0.05)。结果见表2及图1～3。表2  各组在位和异位内膜MVD值比较（略）
       3  讨论
       血管生成这一概念最早由 Hertig于1935 年首先采用，随着分子生物学的发展和血管生成理论的进一步研究，近年来血管生成在EMs的发生与发展中的作用受到广泛重视［2，3］。本实验于造模后 2 周可触摸到大鼠腹壁包块存在；4 周肉眼观大鼠腹壁有一包块隆起，体积较前明显增大，开腹见异位病灶生长良好，呈透亮的小囊状，内部充满积液，表面血管清晰可见，证实EMs血管生成模型造模成功。
       CD31即血小板内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM- 1)，是分子量130kD的跨膜糖蛋白，主要分布在内皮细胞、白细胞上，参与血管生成，并可作为内皮细胞特异标记物，进行组织微血管记数。微血管密度(MVD)是对新生血管生成做出定量描述的一个指标。本研究通过检测EMs模型大鼠的在位与异位子宫内膜MVD的变化，发现异位内膜病灶区的MVD值明显增高，与Khan等［4］的结果相同，提示病灶的出现及维持与局部血供密切相关。推测异位病灶通过分泌相关血管生成促进因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等刺激血管内皮的增殖、迁移，诱导血管形成增多，为异位内膜提供丰富的血供，为病灶的存在与继续生长提供基础［5，6］；而TNF-α可诱导异位子宫内膜炎性细胞因子MCP-1，IL-6，IL-8等的释放，炎性细胞浸润、促进基质细胞增殖、新生血管生成、组织粘连，从而形成异位病灶［7］。本实验亦发现模型组在位内膜MVD较正常组和假手术组高，与Bourlev等［8］的研究结果一致，推测由于异位病灶的存在，EMs在位内膜亦处于高增殖状态，局部 MVD 增高，在血管形成中起主要作用的 VEGF-A 及其受体 VEGFR-1 和VEGFR-2 表达均增高；而在位内膜与异位内膜之间可能存在异质性，致使模型大鼠在位内膜较正常组和假手术组子宫内膜的 MVD 增高，但无统计学意义。
       姜黄素是从姜黄属中药莪术、姜黄、郁金等的块茎中提取的一种植物多酚成分。本实验观察到实验所用动物用药前后活动及饮食均良好，体重无明显改变，说明姜黄素用药安全，无明显毒副作用［9］。近年大量研究发现姜黄素在体内及体外均可抑制多种肿瘤的生长。亦有报道姜黄素可使肿瘤 MVD 显著下降，其发挥作用的机制可能与下调 NF-kappaB，抑制 iNOS，COX-2活性有关［10］，也可能是通过抑制 VEGF 及其受体Flt-1，KDR 的合成、分泌和表达，进而抑制肿瘤组织内血管生成［11］。本研究结果显示姜黄素治疗后在位内膜的 MVD 均有下降，但与正常组和假手术组相比均无明显差异；姜黄素可显著缩小EMs模型大鼠异位病灶的体积，异位组织内新生血管的数量明显减少。推测通过降低在位及异位内膜中 VEGF 及 TNF-α 的表达而达到治疗的目的（另文发表）。说明 EMs 模型大鼠在位内膜与异位内膜对药物姜黄素抑制血管生成的反应不一，而姜黄素能显著抑制EMs模型大鼠异位移植物的血管生成，且呈剂量依赖性，提示姜黄素对EMs的治疗具有潜在的应用前景。
       总之，本实验为目前EMs的药物治疗提供了一个新选择，但当前的研究仅限于动物实验，而姜黄素活性成分种类较多，如姜黄素Ⅰ、姜黄素Ⅱ和姜黄素Ⅲ，究竟是哪种成分发挥作用尚未可知，发挥作用的机制也较为复杂，诱导效应产生的分子机制也不尽相同，尚未系统、明确地了解，有待于进一步的研究和探索。
       【参考文献】
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