文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究龙眼（Dimocarpus longan lour.）核醋酸乙酯部位的抗氧化活性。方法通过乙醇提取、醋酸乙酯溶剂萃取、硅胶柱层析等方法，分离提取不同的极性组分(Fr1～Fr16)。运用TBA比色法分别测定了Fr8～Fr16各组分的抗脂质过氧化活性、应用Fenton 原理测定了各组分清除羟自由基的活性。结果分离提取得到16个极性不同的组分(Fr1～Fr16)，流分Fr8～Fr16对抑制脂质过氧化物、清除羟自由基均具有较好作用，其中部分流分的活性具有量-效关系。最高的抑制率和清除率可达到68.5%。结论龙眼核醋酸乙酯部位的不同流分均具有一定的抑制脂质过氧化作用和清除羟氧自由基作用。
       【关键词】  龙眼核 抗氧化作用 自由基
       Study on the Anti-Oxidation Effects of Longan Seeds Ethyl Acetate Fraction
       LI Xuehua, WU Nini, LI Fusen, HUANG Yanjun, LONG Shengjing
       Pharmacological College, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the anti-oxidative effect of chemical constituents in Longan seed，ethyl acetate fraction. MethodsDifferent fraction constituents of longan seed were obtained by isolating with ethanol solvent, extracting with ethyl acetate and purifying with colomn chromatography and recrystallization and so on. With the help of TBA spectrometric method, effects of ethyl acetate extract from Longan seed on lipid peroxidation were measured by the determination of malondialdehyde (MDA) that was produced by the lipid peroxidation of liver tissue homogenate and mitochondria induced by cysteine-Fe2+system and on scavenging of hydroxyl radical were determined by Fenton system. ResultsSixteen constituents of longan seed , ethyl acetate fraction(Fr1～Fr16) were obtained. Fraction Fr8～Fr15 could inhibit the lipid peroxidation of liver tissue homogenate and the lipid peroxidation of mitochondria induced by Fe2+-Cys and scavenge hydroxyl radical. Some fractions"s activities are in dose-dependent manners. Conclusion Constituents of longan seed , ethyl acetate fraction have good antilipid-peroxidation effect and scavenge hydroxyl radical activity.
       Key words：Longan seed;  Anti-oxidation effect;  Free radicals
       龙眼Dimocarpus longan lour.俗名桂圆，是无患子科龙眼属植物。其核具有止血、定痛、理气化湿，治创伤出血、疝气等［1］和治狐臭作用［2］，近期有研究表明龙眼核的提取物有降血糖的作用［3］，龙眼果肉及龙眼多糖具有抗氧化的作用［4，5］，但龙眼核中化学成分的抗氧化作用研究尚未见报道。为了对龙眼核作进一步的开发利用，本实验对龙眼核进行了体外抗氧化作用的研究。现报道如下。
       1  材料与仪器
       1.1   材料与试剂
       实验用的原料为石硖龙眼干的核，经广西中医药研究所严克俭助理研究员鉴定，为无患子科植物龙眼的干燥果实。实验用测试样品为龙眼核醋酸乙酯浸膏，再经硅胶柱层析洗脱而得的各流份。
       SD大鼠，体重200～300 g，由广西医科大学实验动物中心提供。
       硫代巴比妥酸（TBA）、盐酸、考马斯亮蓝、硫酸亚铁、半胱氨酸、磷酸水杨酸、过氧化氢等试剂均为国产分析纯试剂。
       1.2  仪器
       设备752N紫外可见分光光度计、FJ-200高速分散匀质机（上海标本模型厂制造）、3145台式高速冷冻离心机、数显式三用电热恒温水温箱（上海跃进医疗机械厂）、精密电子天平、旋转蒸发仪（一台为RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂生产；另一台为上海医械专机厂生产），医用循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），电热恒温水浴锅（北京市医疗设备厂），721型可见分光光度计（上海第三分析仪器厂），PHS-2C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂），SK-1 快速混匀器（江苏省金坛县岸头实验仪器厂），800型离心沉淀器（上海手术器械十厂），HC-TP11-10架盘药物天平（上海精科工厂）等。
       2  方法
       2.1  龙眼核醋酸乙酯流分分离提取及测试样品的制备干燥龙眼核粉末（9.97 kg），4倍龙眼核粉体积的75%乙醇浸泡24 h，过滤，滤渣再重复上述操作6次，合并提取液，浓缩，得到龙眼核乙醇总浸膏1.82 kg。用适量水溶解，再依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚浸膏41 g，醋酸乙酯浸膏41.8 g和正丁醇浸膏156.2 g。实验用的测试样品为醋酸乙酯浸膏，再经硅胶柱层析分离，硅胶薄板鉴定合并相同流份而得，编号为Fr1～Fr16，另外从流分Fr8中重结晶得到的产物为没食子酸乙酯的粗结晶，其编号为Fr 16，每一个样品按一定浓度加双蒸水配制成一系列梯度浓度溶液。分别对各合并流分按下列方法进行抗氧化活性测定。
       2.2  龙眼核醋酸乙酯流分抗脂质过氧化的测定［4］SD大鼠禁食12 h，次日断头处死。迅速取出肝脏，置4℃生理盐水中洗净表面残血，用滤纸吸干水分，称重，用pH 7.4的PBS溶液在冰浴条件下配制成10%肝匀浆备用。取肝匀浆贮备反应液1.00 ml，加入不同浓度的龙眼核测试样品溶液1.00 ml，再加0.10 ml 1.00mmol/L硫酸亚铁、0.02 ml 0.01 mol/ml L-半胱氨酸，无糖PBS溶液补足到相同体积，混匀，37℃水浴15 min，再加入2.00 ml 20% 醋酸终止反应，最后加入1.00 ml0.67% TBA，混匀，沸水中加热15 min，冷却，于3 000 r/min离心10min，取上清液于535 nm处测吸光度值A，每个样品做3个平行实验并取其平均值，以获取脂质过氧化物终产物丙二醛含量。空白管用PBS溶液代替，对照管不加样品液，以0.1 ml TEP（50 μmol/L）产生的丙二醛作为标准，求出丙二醛的生成量和对脂质过氧化物的抑制率(I%)。然后根据抑制率与样品浓度的量效关系，若为线性关系，则求出其回归方程和相关系数r，根据方程求出抑制率达50%时所需的样品量IC50。
       
       I（%）=A对照-A试样A对照-A空白×100%
       2.3  龙眼核醋酸乙酯流分对羟氧自由基清除作用的测定［6］根据Fenton反应原理，H2O2在Fe2+存在的情况下生成·OH：Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-，·OH可使番红花T褪色，即在520 nm可测出·OH的生成情况，进而检测出加入样品的抗氧化活性。在试管中加入0.75 mmol/L pH值为7.4的磷酸缓冲液1.0 ml，520 μg/ml番红0.1 ml，2 mmol/LEDTA-Fe2+ 0.5 ml，再加入不同量的样品溶液,最后加入3%的H2O2 0.5 ml（新鲜配制），双蒸水补至总体积为5.1 ml，混匀后于37℃水浴保温30 min，然后在波长520 nm处测吸光度A值。每个样品作3个平行样，取其平均值。空白组以等体积的双蒸水代替样品溶液，对照组以等体积的双蒸水代替样品溶液和FeSO4溶液。阳性对照以苯甲酸代替样品溶液。实验结果以清除率E表示：E（%）=A试样-A空白A对照-A空白×100%
       
       然后根据清除率与样品浓度的量-效关系，若为线性关系，则求出其回归方程和相关系数r，根据方程求出清除率达50%时所需的样品量IC50。
       3  结果
       机体内的自由基损伤参与多种生理和疾病过程，如炎症、心血管疾病、风湿和类风湿、衰老以及组织损伤和恶性肿瘤等。机体在正常状态时，呼吸链中就有自由基的产生，但同时机体内存在内源性的抗氧化体系，使自由基的产生和灭活处于一个动态平衡的状态。但当自由基产生过多或清除过慢时，就可造成生物大分子的损伤。脂质过氧化损伤是自由基损伤中的主要危害之一。生物膜富含不饱和脂肪酸，最易受到自由基攻击，引起脂质过氧化损伤。在Fe2+-半胱氨酸自由基发生系统中，由Fe2+-半胱氨酸促使氧自由基的生成，引起链式和支链式反应，使多不饱和脂肪酸进一步发生过氧化形成LPO。MDA是LPO的主要降解产物，其水平可作为评价脂质过氧化程度的指标。
       3.1 龙眼核醋酸乙酯流分Fr8～Fr16抗脂质过氧化作用乙醇提取的龙眼核醋酸乙酯部位分离所得的各流分Fr8～Fr16抗脂质过氧化作用结果如图1所示，图中曲线为Fr8～Fr16不同浓度的水溶液（总浓度小于80μg/ml），对脂质过氧化物的抑制率。从图1中可知，各流分均具有一定的抗脂质过氧化作用，而且随着样品浓度增加，抑制率也逐渐增加，测试样与抑制率呈一定的量效关系；当样品浓度达75 μg/ml时，Fr11和Fr14抑制率可分别达65.5%和68.5%；当样品浓度增加超过50 μg/ml时，各流分的抑制率基本不变，趋于稳定，说明龙眼核醋酸乙酯Fr8～Fr16流分的抗脂质过氧化物作用存在一有效浓度范围，其抗脂质过氧化作用能力只需在较小量的浓度范围内就能发挥较好的作用。
       
       从表1可知，当样品浓度小于50 μg/ml浓度范围时，Fr9，Fr10，Fr13流分抑制率与浓度线性关系较好，相关系数r分别为0.992 2，0.996 8，0.990 6；从各流分的抗脂质过氧化物的IC50看，它们的抗脂质过氧化物能力的大小顺序为：
        从表1中IC50顺序：Fr16       3.2  龙眼核醋酸乙酯流分Fr8～Fr16对羟氧自由基·OH的清除作用乙醇提取的龙眼核醋酸乙酯部位分离所得的各流分Fr8～Fr16对羟氧自由基清除作用如图2所示。图2中曲线为Fr8～Fr16流分的不同浓度的水溶液（总浓度小于0.70 mg/ml），对·OH自由基的清除率。从图2可知龙眼核醋酸乙酯流分Fr8～Fr16在浓度小于0.70 mg/ml时均具清除由EDTA Na2-Fe(Ⅱ)-H2O2体系产生的·OH作用，且呈一定的量-效关系，即随着样品浓度的增大，清除率逐渐增加，最高清除率可达68%。图2中曲线及表2中的r值也显示其中样品Fr10，Fr12，Fr16浓度与清除率具有良好的线性关系。但Fr16和Fr12的清除率不受浓度范围的限制，提示可成为不错的清除·OH的活性成分。
       从表2可知，与阳性对照苯甲酸的IC50比较，相关系数较好的流份Fr10，Fr12及Fr16的IC50都比阳性对照的高，说明其具有很好的清除羟氧自由基作用。表2  龙眼核醋酸乙酯流分Fr8～Fr15对羟氧自由基清除作用IC50（略）
       从图1与图2对比看，龙眼核醋酸乙酯的水溶性流份Fr8～Fr16清除羟氧自由基的结果与抗脂质过氧化作用具有相似的结果。但在清除羟氧自由基的测定中，Fr8和Fr16流分虽具有相同主要成分，其清除效率却不同，也与样品的抗脂质过氧化物作用具有相似的结果不同，可能与Fr8流分的其它成分存在协同作用有关，提示不同的活性氧有时需要不同的抗氧化剂。
       4  讨论
       本实验通过对乙醇提取的龙眼核醋酸乙酯部位分离所得的各流分Fr8～Fr16的体外抗脂质过氧化活性、清除羟氧自由基的活性测定研究，为寻找和追踪龙眼核有效的抗氧化活性物质提供实验依据。Fr8～Fr16流分样品的水溶解性较好，抗氧化活性量效线性趋势明显，这些流份有较好的抗氧化活性，可成为较理想的抗氧化剂。结合化学分离结果分析，从Fr8流分中反复重结晶得到Fr16是化合物没食子酸乙酯，对Fr8以后的流分，经对其化学成分进行定性实验，发现其主要成分为多酚类物质，多酚类物质被公认为抗氧化类物质。综合抗脂质过氧化结果和清除羟氧自由基结果，可推测，龙眼核醋酸乙酯水溶性流份活性及变化趋势可能和偏极性含多酚类物质如鞣质成分等有关。大量的研究表明多酚类化合物具有很好的抗氧化活性，共轭苯环上含有的酚羟基可以参与自由基的化学电子转移过程，从而发挥抗氧化作用［7］。在清除羟氧自由基实验中，酚类物质所含的酚羟基与自由基反应可形成稳定半酮式自由基结构，从而终止自由基链式反应,这是酚羟基化合物清除自由基的最主要机制［8］。这有待对龙眼核化学成分进一步的分离研究，以确定其构效关系。
       【参考文献】
         　　［1］江苏新医学院.中药大辞典(上册)［M］.上海:上海科学技术出版社,1986:636.
       
       ［2］陈贵延.本草纲目通释(下册)［M］.北京:学苑出版社,1992:149.
       
       ［3］黄儒强,刘学铭,曾庆孝.龙眼核提取物对β-葡萄糖苷酸抑制作用的研究［J］.现代食品科技,2005,21(2):62.
       
       ［4］李雪华,龙盛京,谢云峰，等.龙眼多糖、荔枝多糖的分离提取及其抗氧化作用的探讨［J］.广西医科大学学报,2004,21（3）:342.
       
       ［5］吴华慧，李雪华,邱 莉，等.龙眼、荔枝果肉及龙眼、荔枝多糖清除氧自由基的作用［J］. 食品科学,2004,25:166.
       
       ［6］刘 刚,王 辉,张先洲,等.青藤碱清除氧自由基和抗脂质过氧化作用 ［J］.中草药,2006,37（1）:84.
       
       ［7］Salah N,Miller NJ,Paganga G,et al.Polyphenolic flavanols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-braekinng antioxidants［J］.Arch Biochem Biophys,1995,322(2):339.
       
       ［8］魏朝良,于德红,安利佳.黄酮类化合物及清除自由基机制的探讨［J］.中成药, 2005, 27(2): 239.