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       【摘要】 
       目的建立吴茱萸的HPLC指纹图谱分析方法。方法高效液相色谱（HPLC）分析，Diamond C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，柱温35℃；流动相为乙腈－0.1%磷酸梯度洗脱，流速1.0 ml/min；检测波长327 nm。结果建立了吴茱萸的指纹图谱，标定了14个共有峰（RSD≤3.0%），符合有关规定。结论HPLC指纹图谱为吴茱萸的质量控制提供了更全面的信息，可较全面地控制吴茱萸的质量。
       【关键词】  吴茱萸 高效液相色谱 指纹图谱
       Fingerprints of Fructus Evodiae by HPLC
       LIU Boping ，TAN Wen，HONG Shuhua，TAN Rui
       School of Bioengineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，China
       Abstract：ObjectiveTo study the HPLC fingerprint of Fructus Evodiaea. MethodsChromatographic column:Diamond C18 column（4.6 mm×250 mm,5 μm）;Mobile phase: acetonitrile and 0.1% phosphoric acid in water in a gradient mode；Column temperature:35℃;Flow rate: 1.0 ml/min;Wavelength:327 nm.ResultsThe fingerprint of Fructus Evodiae was established and 14 common peaks（RSD≤3.0%） were found in the fingerprint, and reached to some relevant provision. ConclusionThe HPLC fingerprint provided much further information for the quality control of the Fructus Evodiaea, and can be used to control the quality of Fructus Evodiaea.
       Key wordsFructus Evodiae；  HPLC ；  Fingerprints
       
       吴茱萸（Fructus Evodiae）为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.） Benth.及疏毛吴茱萸Evodia rutaeca（Fuss.）Benth. var. bodinie（Dode）的干燥近成熟果实。具有散寒、止痛、降逆、助阳、止泻的功效，近代药理研究发现尚具有扩张血管、降压、强心等功效。吴茱萸的性味辛、苦、热，有小毒。常用于厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸、五更泄泻等症的治疗［1］。
       指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的手段，其根据色谱指纹图谱的模糊属性，着眼于宏观的规律性的特征分析，而不是求索细枝末节。目前，多用吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量控制吴茱萸的质量，但不能全面反映吴茱萸中其他成分的情况，难以真正控制其质量。因此，本文建立了吴茱萸的指纹图谱分析方法。对10批全国不同产地来源吴茱萸进行了分析，并进行方法学考察，初步建立了指纹图谱，并标定了14个共有色谱峰［2］。
       1  器材
       1.1  仪器
       
       岛津LC-10A高效液相色谱仪，二级管阵列检测器（DAD），岛津CLASS-VP色谱工作站，超声波清洗器SB2200-T，1/10000电子分析天平（北京赛多利斯），中药色谱指纹图谱相似度评价系统（中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件2004版A）。
       1.2  试剂
       乙腈为色谱纯（美国Fisher公司），水为超纯水，磷酸为分析纯。
       1.3  材料
       对照品，吴茱萸碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号110802-200504）。实验中所用吴茱萸来自峨眉山（No.1）、广元(No.2)、德阳(No.3)、温江(No.4)、安徽(No.5)、甘肃(No.6)、贵州(No.7)、广西(No.8)、云南(No.9)、浙江(No.10)，经鉴定为芸香科吴茱萸属植物吴茱萸Evodia rutaecarpa （Juss.） Benth.的干燥近成熟果实。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱为迪马Diamond C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱，流动相B为乙腈，流动相A为0.1%磷酸，采用梯度洗脱（梯度程序见表1），流速1.0 ml/min，柱温35℃，检测波长327 nm，进样量10 μl，记录时间140 min。表1  梯度洗脱程序（略）
       2.2  对照品溶液的制备［3］ 
       精密称取吴茱萸碱对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.4 mg的吴茱萸碱溶液，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
       2.3  供试品溶液的制备 
       取吴茱萸药材粉末（过40目筛）1.0 g，精密称定，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25   ml，称定重量，超声30 min，放冷后称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
       2.4  方法学考察
       2.4.1  对照实验
       吸取对照品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1。
       2.4.2  精密度实验
        
       取同一份吴茱萸药材的供试品溶液，连续进样6次，考察色谱峰相对保留时间及相对保留面积的一致性。结果表明各主要色谱峰相对保留时间的RSD均低于3.0%，相对峰面积的RSD均低于3.0%，精密度良好。
       2.4.3  稳定性实验
        
       取同一份吴茱萸药材的供试品溶液分别在0，4，8，12，24，48 h进行检测，考察色谱峰相对保留时间及相对保留面积的一致性。结果表明各主要色谱峰相对保留时间的RSD均低于3.0%，相对峰面积的RSD均低于3.0%，稳定性较好。
       2.4.4  重现性实验
       取同一批吴茱萸药材6份供试品溶液，进行检测，考察色谱峰相对保留时间及相对保留面积的一致性。结果表明各主要色谱峰相对保留时间的RSD均低于3.0%，相对峰面积的RSD均低于3.0%，重现性较好。
       2.5  指纹图谱的建立
       2.5.1  吴茱萸药材指纹图谱共有峰的标定
       按供试品溶液的制备方法操作，分别取各批次不同产地药材制成样品溶液，在上述色谱条件下，记录色谱峰，结果见图2。从中总结出吴茱萸指纹图谱中典型的14个色谱峰（其中13号峰为S峰）。见图3。
       2.5.2  吴茱萸药材指纹图谱相似度检验
       用中国药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”（2004版A）进行数据处理。将10批次吴茱萸药材的指纹图谱结果导入“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”系统，采用“中位数法”导出10批次药材指纹图谱的总共有模式，再将10批次药材指纹图谱与导出的总共有模式进行比较，得到各批次药材的相似度。10批次吴茱萸药材的指纹图谱相似度评价结果均大于0.90，符合指纹图谱研究技术的要求［4］。结果见表2。表2  10批不同产地吴茱萸药材相似度计算结果（略）表3  10批吴茱萸指纹图谱各共有色谱峰相对保留时间（略）表4  10批吴茱萸指纹图谱各共有色谱峰相对保留面积（略）
       3  讨论
       3.1  提取方法的考察
       通过对不同提取溶剂、提取方法进行实验比较，以吴茱萸的色谱图为依据进行综合分析，得到上述供试品溶液的制备方法为最优方法［5］。
       3.2  流动相的考察
       实验过程中对比不同的流动相体系：甲醇-水、甲醇-1%醋酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.4%磷酸，其中以乙腈-0.1%磷酸进行梯度洗脱能使各成分得到较好的分离，故选用此流动相［4］。
       3.3  波长的考察
       采用二级管阵列检测器对检测波长进行考察，记录并比较不同波长的色谱图，结果在327 nm处，吴茱萸色谱图中色谱峰较多，分离度较好，故选择327 nm为检测波长［6］。
       色谱指纹图谱是通过对各样品色谱图进行比较，来反映样品化学成分的差异。在指纹图谱相似度计算中，一般将所选取的色谱峰同时作比较计算，反映了指纹图谱的整体相似性，可对中药产品质量作出较全面、准确地评价［7～9］。本次实验结果表明：在药材产地，采收，干燥方法等相对确定的前提条件下，利用色谱指纹图谱来控制吴茱萸的质量优劣是切实可行的，它比现行质量标准要更全面、客观。它为吴茱萸药材的品种鉴定和质量评价提供可靠依据，也为其质量控制提供了更全面的信息。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会．中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：31.
       
       ［2］蔡光先，李顺祥．吴茱萸超微饮片的HPLC指纹图谱研究［J］.科技导报，2006，24（8）：40.
       
       ［3］王月辉，乔 斌，蒋建兰，等．马钱子药材HPLC指纹图谱的研究［J］.中草药，2006，37(8)：1254.
       
       ［4］李玉娟，王 瑞，车镇涛，等．中药材指纹图谱质量控制方法研究［J］.中药新药与临床药理，2001，12（3）：193.
       
       ［5］洪玉梅，蔡 嵩，高慧敏，等．中药吴茱萸RP-HPLC指纹图谱的研究［J］.中国药学杂志，2006，41（12）：895.
       
       ［6］甄 攀，王治宝，白雪梅，等．吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的分析［J］.中成药，2004，26(3)：228.
       
       ［7］王晃，李梦龙，覃洁萍，等．建立中药指纹图谱保证中药产品质量［J］.成都中医药大学学报，2002，25(3)：45.
       
       ［8］任德全．中药指纹图谱质控技术的意义与作用［J］.中药材，2001，24(4)：236.
       
       ［9］侯小平，何新新，苏薇薇．中药指纹图谱质量控制技术［J］.中药材，2001，24(5)：370.