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       【摘要】 
       目的确定白背三七多糖的最佳提取方案，对其多糖进行分离纯化和含量测定。方法建立正交实验，对其提取方案进行优化；通过Sevage法脱蛋白、乙醇沉淀以及DEAE－52柱层析进行分离纯化；蒽酮-硫酸法测定其总多糖含量。结果温度90℃，固料比1:9，提取时间2 h；提取次数2次，所得多糖的含量最高。蒽酮-硫酸法测得粗多糖含量为1.49%；DEAE－52柱层析分离纯化分别得到组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ。结论水提白背三七多糖工艺简便，投资少，有利实现工业化大生产。
       【关键词】  白背三七 多糖 蒽酮-硫酸法
       The Extraction，Purification and Determination of Polysaccharide in Gynuradivaricata(L.)DC.
       JIANG Manhua，QIU Ximin* ， LIU Shengzi，  PENG Sheng，  LI Q  iang
       （Medical College of Hunan Normal University, Changsha, Hunan 410006, China）
       Abstract：ObjectiveTo fix an optical extractive method and to make separation，purification and content determination of polysaccharide in Gynuradivaricata(L.)DC. MethodsOrthogonal experiment was introduced to study the  optimum extraction process of Gynuradivaricata(L.)DC. polysaccharide (GDPS）. The polysaccharide was purified using sevage deprotein and DEAE-52 column chromatography.To make content determination with the method of anthranone-sulphuric acid.ResultsThe optimal extracting conditions were:extracting temperature 90℃， the ratio of solid and liquid 1:9； extracting time 2h and extracting twice;the content percentage of rude polysaccharide was 1.49%. GDPSⅠ、Ⅱ、Ⅲ were obtained through DEAE-52 column chromatography.ConclusionIt"s simple, costless to extract polysaccharide with water-boiling method.
       Key words：Gynura divaricata(L.)DC.;  Polysaccharide;  Extraction and purification;  Content determination
       
       白背三七Gynuradivaricata(L.)DC.为菊科三七草属植物，又名白(百)子菜，分布于台湾至华南、西南一带，喜生于潮湿的阴地上［1］，根、茎、叶均可入药，其根及根茎味甘，性凉，有清热、凉血、散淤消肿之功效，用于咳嗽痰喘、肺痈、崩漏、烫伤、跌打损伤、刀伤出血等症；而茎叶味咸，微辛，性凉，有消热，舒筋及止血，祛淤的作用，用于镇咳、风湿性关节痛、骨折、创伤出血、痈肿疮疥等症。在民间则作为一种保健野菜，由于其能促进人体新陈代谢，增强体力，滋补强身，延年益寿而备受青睐。湖南岳阳地区众多糖尿病患者长期食用，有效控制了血糖升高，因不知植物名而被患者称为“救命草”。网上则称其为“神奇的植物”，也有称其为“明日叶”或“明日草”等。药理学研究表明，多糖(polysaccharide) 是构成生命的四大基本物质之一，多糖在增强免疫力［2］、降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面发挥着生物活性作用。因此对多糖的研究与开发已越来越引起人们的广泛关注。关于白背三七栽培技术文献报道较多［3］，化学活性成分仅见该植物吡咯啶生物碱［4］、黄酮类成分［5，6］及脂肪酸成分分析［7，8］的报道，尚未见其多糖的研究报道。本文报道白背三七多糖的提取纯化及含量测定。
       1  器材
       1.1  仪器UV-2501 PC紫外分光光度计，DEAE-52层析柱
        
       1.2    药材与试剂无水乙醇、浓硫酸、蒽酮、氯仿、正丁醇（均为分析纯）、葡萄糖标准品（国药集团化学试剂有限公司）、白背三七药材（岳阳市场上购买）。
       2  方法
       2.1  白背三七多糖的提取
       2.1.1  提取温度的确定 取已干燥的药材15 g，按药材：石油醚＝1:3进行脱脂，脱脂后的药材按1：7的比例，以水为溶剂，分别在不同的温度下提取2次，提取2 h/次。
       2.1.2  提取时间的确定取已干燥的药材15 g，按药材：石油醚＝1:3进行脱脂，脱脂后的药材按1：7的比例，以水为溶剂，90 ℃下，不同持续提取时间下提取2次。
       2.1.3  料液比的确定取已干燥的药材15 g ，按药材：石油醚＝1:3进行脱脂，脱脂后的药材90 ℃下，按不同的料液比提取2次，提取2 h/次。
        
       2.1. 4  提取次数的确定取已干燥的药材15 g，按药材：石油醚＝1:3进行脱脂，脱脂后的药材90 ℃下，提取2 h/次，提取不同次数。
       2.1.5  正交实验通过单因素实验确定最佳因素水平，为了消除各因素间的相互影响，根据这些确定的因素，确定正交因素的各个水平。根据各实验因素水平即提取时间、提取温度、固液比、提取次数4因素3个水平按表1进行正交设计提取。见表1。
       表1  因素与水平（略）
       2.2  脱蛋白本实验采用sevage法脱蛋白，粗多糖加适量水溶解，加入1/5体积的sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），强烈振摇30 min。静置分层，除去交界处变性蛋白，重复处理3次。在200~400 nm处扫描未见蛋白质吸收峰。
       2.3  粗多糖的分离纯化
       2.3.1  粗多糖初步分离纯化 收集提取液，于离心机3000 r/min-1离心10 min，取上清液。加入3倍量95%的乙醇，冰箱冷藏24 h，次日于离心机3000 r/min-1离心20 min，取沉淀，用丙酮，乙醚各洗涤3次，冷冻干燥，得灰白色粉末状的粗多糖。
       2.3.2  DEAE-52柱层析分离纯化
        
       DEAE-52预处理：取DEAE-52适量，用蒸馏水浸泡，分别用0.5 mol·L-1的NaOH及0.5 mol·L-1 HCl处理30 min，抽干用蒸馏水洗至中性后， 用pH 6.0磷酸缓冲液处理后脱气装柱。
       
       DEAE52柱层析：采用DEAE52柱层析(30 cm×2.5 cm)进行色谱分离，上样前用双蒸水平衡2 h，取0.05 g·ml-1白背三七多糖样品上柱，待其渗入DEAE52后，用双蒸水以1 ml·min-1流速洗脱，10 ml管收集。隔管用蒽酮－硫酸法在626 nm处测定吸光度，直至无洗脱峰洗出为止。继而用0.05%，0.1%，0.3%，0.5 KCl ，以1 ml·min-1流速梯度洗脱，10ml管分部收集。蒽酮-硫酸法626 nm波长处检测，至洗脱液吸光度为0时更换梯度，根据所得吸光度值作多糖洗脱曲线。
       2.4   粗多糖含量测定［9］
       2.4.1    蒽酮试剂的配制［10］称取1 g蒽酮溶解于500 ml 80%的硫酸中，置入棕色瓶中，暗处静置，临用临配。
       2.4.2  波长选择称取105℃干燥恒重的葡萄糖适量，加水溶解使成240.0 mg/L作对照品溶液。取对照品溶液0，0.5 ml置具塞试管内，分别加水1.0，0.5 ml，加入新鲜配制的蒽酮试剂(0.2%蒽酮的80%硫酸溶液)8.0ml沸水浴加热10 min，迅速置冰水浴冷却10 min后，以首管为空白，在500~700 nm处扫描，确定最大吸收波长为626 nm。
       2.4.3  标准曲线的绘制 称取干燥恒重的葡萄糖适量，加水溶解使成240.0 mg/L，精密量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 ml置具塞试管内，加水至1.0 ml，分别编号为0，1，2，3，4，5，6再分别加入新鲜配制的蒽酮试剂(0.2%蒽酮的80%硫酸溶液)8.0 ml沸水浴加热10 min，迅速置冰水浴冷却10 min后，以首管为空白，在626 nm处测定吸收度，以浓度对吸收度作工作曲线。
       2.4.4  稳定性实验 以标准系列4号管(即0.4 ml标样管)作稳定性考察，在626 nm处于0，30，60，90，120 min测其吸光度。
       2.4.5   加样回收实验精密称取已知多糖含量的样品4份，加水稀释至100 ml，取0.1 ml，加入240 mg/L葡萄糖对照品溶液0.1 ml，加水溶解并定容至100 ml，取溶液适量，按“2.4.3”项下方法操作，626 nm处测定吸收值，代入工作曲线方程，将所得结果换算成质量，计算出回收率。
        
       2.4.6  总多糖含量测定精密称取多糖0.201 0 g，溶解配成100 ml溶液，取0.1 ml同“2.4.3”项下方法处理，在626 nm波长处测定吸光度，代入曲线回归方程得总多糖的浓度。
       3  结果
       3.1  正交实验结果见表2。
       
       通过正交实验可知：提取最佳条件为A2B3C1D2，即提取温度90 ℃，固料比1∶9，提取时间2 h；提取次数2次时，提取效果最好。因素影响顺序分别为提取温度>固液比>提取次数>提取时间。
       表2  正交实验结果（略）
       3.2  多糖含量测定
       3.2.1   标准曲线的绘制 标准曲线有关数据见表3。
       表3  标准曲线绘制（略）
       以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程A= 0.005 1C +0.004  r=0.9998，结果（表3）表明在24~192 μg范围内葡萄糖含量与吸光度呈良好的线性关系.。白背三七样品吸光度为0.15703，将其代入回归方程得到C=30.0(μg/ml)。
       
       多糖的含量(％)= C×D×VW×100％＝1.49％
       3.2.2  稳定性实验结果由表4可知，吸光度测定在120 min内相对标准误差为0.6%，表明多糖采用蒽酮-硫酸显色在120 min内稳定。
       表4  稳定性实验结果（略）
       表5  加样回收实验结果（略）
       3.2.3   加样回收实验结果由表5可知，本法回收率为96.58%~100.50%，平均回收率为98.90%，相对标准偏差（RSD） 为2.0%。结果表明该方法的准确度较高。
       3.3  多糖分离纯化结果 将白背三七粗多糖以不同浓度KCl为洗脱溶剂过DEAE-52层析柱，洗脱曲线见图1。有3个洗脱峰。将此3个洗脱峰组分分别命名为组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ。
       4  讨论
       4.1  提取条件实验采用单因素确定正交因素水平，建立正交实验方法，对白背三七多糖的提取条件进行了优化。由单因素实验和正交分析结果可知该多糖提取中，温度是主要影响因素，其次是固液比；提取时间和提取次数影响不显著。因此在提取时应注意控制提取温度和固液比，该工艺条件简单，稳定可行，多糖提取率高，稳定性好，可作为总多糖的提取工艺条件，为有效开发利用白背三七提供了方法学基础。
       图1  DEAE-52 洗脱曲线（略）
       4.2  纯化工艺采用DEAE－52 柱层析纯化，分别用蒸馏水以及0.05％，0.1％，0.3％，0.5％的KCl进行了分离纯化，根据洗脱曲线，主要得到3个洗脱峰，由此可初步判断白背三七中至少含有三种多糖成分，其中以0.05％KCl洗脱峰面积最大，推测此为该药材中含量最高的多糖部分。
       4.3   含量测定采用蒽酮－硫酸法测定粗多糖的含量，与陈文［11］等人在测定白术时采用的苯酚硫酸法相比较，该法无需进行苯酚蒸馏等显色试剂预处理，操作简单，稳定性好。在现代研究中，可通过测定生理活性成分含量来衡量白背三七有无药用开发价值，因此此方法的确立可为白背三七开发利用提供一定的科学依据。
       
       综上所述，白背三七中多糖尚待进一步研究，通过基础的提取方法的确定和纯化，为进一步的分析鉴定和多糖药理研究奠定了基础。
       【参考文献】
         　　［1］ 广东植物研究所.海南植物志［M］.北京:科技出版社，1974：416.
       
       ［2］ 李丽立，张 彬，朱南山，等.白术多糖对早期断奶仔猪部分免疫性能的影响［J］.农业现代化研究，2007，28(4):487.
       
       ［3］ 梁 萍.时尚野菜富贵菜高产栽培技术［J］.广西农学报，2006，23(3):4.
       
       ［4］ Roeder E，Eckert A，Wiedenfeld H. Pyrrolizidine alkaloids from Gynura divaricata ［J］.Planta Medica，1996，62(4):3861.
       
       ［5］ 胡 勇，李维林，林厚文，等.白背三七地上部分的化学成分［J］.中国天然药物，2006，4(2):156.
       
       ［6］ 黄 骐，林荣华，郑 钊.白子菜总黄酮含量的测定［J］.福建师范大学学报(自然科学版)，2006，22(2): 118.
       
       ［7］ 郭巨先，杨 暹.华南主要野生蔬菜的脂肪酸成分分析［J］.中国野生植物资源，2004，23 (2):47.
       
       ［8］ 郭巨先，杨 暹.华南主要野生蔬菜基本营养成分及营养价值评价［J］.食品科学，2002，23(11):102.
       
       ［9］ 邱细敏，卢岳华，沈 品，等.不同产地白术多糖含量测定［J］.中国药业，2005，14(4):40.
       
       ［10］ 张惟杰.糖复合物生化研究技术，第2版［M］.杭州:浙江大学出版社，1999:112.
       
       ［11］ 陈 文，李丽立，姜曼花，等.平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究 ［J］.时珍国医国药，2007，18(4):815.