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       【摘要】 
       目的探讨川芎嗪对脑挫伤半暗带皮质神经元抗凋亡基因Bcl-2表达的影响。方法采用Fenne" s自由落体法，复制大鼠脑挫伤动物模型，采用川芎嗪进行治疗，第24小时和72小时取脑切片进行SP免疫组织化学染色。采用图象分析技术统计半暗带区Bcl-2阳性神经元数密度和灰度。结果治疗小剂量和大剂量组（1，2组）Bcl-2阳性细胞数目和深度高于假手术组和模型组（P<0.05），72 h组明显高于24 h治疗组（P<0.05）。结论川芎嗪对脑挫伤半暗带Bcl-2有明显的上调作用，从而减轻半暗带神经元损伤。
       【关键词】  川芎嗪 脑挫伤 半暗带 免疫组织化学
       Effects of Ligustrazize on Bcl-2 Gene Expression in Penumbra of Brain Cerebral Injury
       LI Haifeng, ZHANG Hui, LI Weidong, BO Aihua
       （Hebei North University, Zhangjiakou 075029, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of ligustrazize on expression of Bcl-2 gene in cerebral injury penumbra.MethodsThe rats were reconstructed model of brain injury by Fenne" s method,and treated wich ligustrazize. After 24 h and 72 h section,the brain were stained by immunohistochemistry method. The numerical density and average gray value of Bcl-2 positive cell were observed by image analysis in cerebral penumbra. ResultsIn ligustrazize treated group( little dosage and large dosage). Positive cells of Bcl-2 were increased and the average gray value was elevated as compared with sham operated group and model group (P<0.05) . 72 h group was significantly higher than 24 h group（P<0.05）. ConclusionThe ligustrazize can promote expression of Bcl-2 gene and decrease neuron damage in penumbra area.
       Key words：Ligustrazize；  Brain injury；  Penumbra；  Immunohistochemistry
       
       头颅受到重物捶击，导致局部脑组织挫裂伤，伤灶中心区发生出血和组织碎裂，伤灶周围区神经组织虽有短时间缺血缺氧损伤，但神经元尚可恢复，此区被称为“半暗带”(penumbra)。目前对于半暗带的形成机制有不少报道［1，2］，但是中药对半暗带基因表达的影响报道甚少。本实验利用Fenne"s的方法复制大鼠脑挫伤模型，利用免疫组织化学技术观察川芎嗪对凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响，为阐明川芎嗪治疗脑挫伤的机制提供科学依据。
       1  材料与方法
       1.1  动物及脑挫伤模型复制利用成年Wistar大鼠40只,雌雄兼用。假手术组10只，模型对照组10只，治疗1，2组（小、大剂量）各10只。利用Feene"s自由落体法，复制端脑顶叶脑挫伤动物模型。伤后立即腹腔注射川芎嗪液（500 mg/kg或 100 mg/kg），1次/d，共3 d。
       1.2  取材及切片脑挫伤后24 h和72 h戊巴比妥钠麻醉大鼠，迅速取脑，平漏斗前后缘冠状切开，取脑片（约1 mm厚度）假手术对照及模型组与治疗组同时杀死取材。将脑片在10%甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋和切片，切片厚度6 μm。
       1.3  免疫组织化学染色 Bcl-2抗血清及SP试剂盒及DAB显色剂，均购自北京中杉金桥生物公司，免疫组织化学染色程序严格按照试剂盒说明书操作。
       1.4  结果分析 Bcl-2阳性细胞质呈棕黄色，核不着色。利用彩色图象分析仪和北航提供的分析软件检测Bcl-2阳性细胞的数密度(细胞个数/mm3)及灰度(为相对数,数值大色浅,数值小色深)以此表示Bcl-2阳性物质的含量及阳性细胞的多少。
       1.5  统计学分析 组间比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性。
       2  结果
          
       假手术组Bcl-2阳性细胞色浅而且阳性数目很少；模型组中Bcl-2阳性细胞在皮质半暗带中有所增加，而且与对照组有显著差异，而川芎嗪治疗组，则随伤后治疗时间而上调。其变化见表1。
       
       表1提示模型对照组Bcl-2阳性细胞数目和着色深度与假手术组有明显差异（P<0.05），72 h阳性细胞数目明显高于24 h阳性细胞数目；大剂量组明显高于小剂量组（P<0.05）。
       表1  皮质半暗带Bcl-2阳性细胞数密度和灰度（略）
       3  讨论
          
       研究表明，脑部缺血性损伤（缺血再灌注或挫伤）的病理形态学改变可以区分核心区及半暗带，核心区为细胞坏死性死亡而不可逆转；半暗带则为低灌区，能量代谢保存，细胞功能受损，呈可逆过程［3］。如何使用脑保护剂，可以使损伤减轻，减小损伤区并尽早恢复功能，这是目前人们关心的问题。由于细胞凋亡是半暗带神经元损伤程度的重要指标，因此抗凋亡措施将是减轻半暗带损伤的重要策略。本实验利用中药川芎嗪治疗脑挫伤，观察了皮质半暗带抗凋亡基因Bcl-2的表达状况,发现24h和72h半暗带Bcl-2阳性神经元增多，与模型组和假手术组织相比较有显著性差异(P<0.05)。关于Bcl-2是研究最早、最多的抑制凋亡基因，其编码产物为分子量25~26 KD的跨膜糖蛋白，位于核膜及内质网膜，线粒体膜上。研究发现创伤性脑损伤后，存活神经细胞Bcl-2表达增高，有人用转基因鼠研究证明Bcl-2过表达可以明显减少神经元死亡［4］。本实验结果与之相符。关于Bcl-2抗凋亡的主要机制有以下途径：①直接抗氧化作用；②抑制线粒体释放促凋亡蛋白，如细胞色素C，凋亡诱导因子等；③抑制促凋亡调节基因Bax，Bak的细胞毒性；④维持细胞钙稳态［5］。
       
       利用中药抑制细胞凋亡是我国开发脑保护制剂的热点。目前，关于黄芪、当归、胡黄连、银杏叶、川芎嗪、灯盏花及中药复方醒脑静等在抗脑细胞凋亡方面的研究均有过报道［6］。 川芎嗪是临床应用比较广泛的活血化淤中药，其中主要化学成分为四甲基吡嗪，虽然已经可以人工合成，但广泛应用的仍然是天然中药提取物或草药煎剂。据报道［7，8］，川芎嗪具有扩张微血管、抑制血小板凝集和改善微循环的作用，而且能够降低缺血导致的自由基增多；提高ATP酶和SOD（过氧化物歧化酶）的活性；抑制微血管内皮细胞与淋巴细胞的黏附力；能下调凋亡激活因子和上调凋亡抑制基因蛋白；阻断Ca2+内流等多种功能，从而对神经细胞有明显的保护作用。本实验证明川芎嗪对凋亡抑制基因Bcl-2表达有明显的上调作用。通过抑制神经元凋亡，达到保护脑组织的效果。关于上调Bcl-2基因蛋白的机制问题可能是多因素、多环节、多途径的，有待进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］ 王贤军,夏 青,蔡洪信.局灶性脑梗死后半暗带皮层血流量与神经细胞凋亡的实验研究［J］.中国病理生理杂志,2006,22（5）：968.
       
       ［2］ Podosech SA,Vogel P, Bottiger BW. Neuronal apoptosis following cerebral ischemia.Basis,phsiophology and treatment stragies［J］.Anaesthesist,2001,50(12):905.
       
       ［3］ Nakamura M,Raghupathi R,Merry DE,et al.Over expression of Bcl-2 is neuroprotective after exprimental brain injury in transgenic mices ［J］.J comp Neurol,1999,412(4):681.
       
       ［4］ 董 斌,罗其中,徐英辉,等.脑缺血半暗带区研究进展［J］.中华神经外科疾病研究进展,2005,4（1）：90.
       
       ［5］ 范广梅,崔泰霞.川芎嗪对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用［J］.新乡医学院学报,2005,22（4）：307.
       
       ［6］ 银建军,张 伟,杜 芳.胡黄连提取物对大鼠脑缺血再灌注后半暗带区细胞凋亡及Bcl-2表达的影响［J］.山东中医杂志,2005,24（6）：364.
       
       ［7］ 赵玉鑫,王 洪,杨述华，等.川芎嗪对大鼠脊髓损伤后caspase-3表达及细胞凋亡的影响［J］.中国中医骨伤科杂志,2006,14（6）：54.
       
       ［8］ 曲有直,高国栋.川芎嗪及联合用药治疗脑缺血再灌注损伤的研究进展［J］.中国临床康复,2004,8（19）：3862.