文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨川芎嗪对脑缺血再灌注皮质Bax mRNA表达的影响。方法采用Wistar雄性大鼠30只，随机分组。A组为正常对照组，B组为模型对照组，C组为川芎嗪治疗组。采用原位杂交与医学图像分析技术检测Bax mRNA阳性细胞数目、平均灰度值。结果大脑皮质Bax mRNA在B组阳性神经元多、着色深，平均数密度值高而平均灰度值低；A组中着色浅、阳性细胞数少，平均灰度值大，二者差异较显著（P＜0.01）。C组与B组比较，Bax mRNA阳性神经元少，平均灰度值升高（P＜0.05）。结论脑缺血再灌注后Bax mRNA表达增强；川芎嗪可使其表达下降，在脑缺血再灌注损伤中起到神经保护作用。
       【关键词】  川芎嗪 脑缺血再灌注 Bax mRNA 原位杂交技术
       Effect of Ligustrazine on the Expression of Bax mRNA after Cerebral Ischemia Reperfusion
       ZHANG Xiaoli，  JIANG Lina，ZHAO Ying， ZHAO Qiuzhen, BO Aihua, ZHANG Hui
       (Experiment Center, Hebei North University, Zhangjiakou,075029，China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of ligustrazine on the expression of Bax mRNA after cerebral ischemia reperfusion in rat brains. MethodsThirty male wistar rats were randomly divided into three groups, group A: normal control group (n=10), group B: model control (n=10), group C: ligustrazine intervention group (n=10). The in situ hybridization and MIPS were used to measure the number and mean gray level of Bax mRNA positive cells in cerebral cortex of the three groups.ResultsThe cerebral cortex Bax mRNA in group B had more positive neuron and was strained deeper. The average numerical density was high, but mean gray level was low. In group A, the expression of Bax mRNA was slreined shallowand had less positive cells, but mean gray level was higher.There was significant difference between group A and group B(P＜0.01). Compared with group B, the number of Bax mRNA positive cells in group C was increased and mean gray level was elevated(P＜0.05). ConclusionThe expression of Bax mRNA was increased after cerebral ischemia reperfusion. Ligustrazine can down-regulate the expression of Bax mRNA and protect neron from cerebral ischemia reperpusion injury.
       Key wordsligustrazine；  Cerebral ischemia reperfusion；  Bax mRNA;  In situ hybriddization
       
       细胞凋亡是维持神经系统正常生长发育的重要机制，脑缺血可诱发凋亡，脑缺血再灌注后凋亡的细胞主要为神经细胞和血管内皮细胞。川芎嗪是伞形科藁本属中药川芎的有效成分之一，化学结构为四甲基吡嗪，具有活血化淤、扩张血管、抑制血小板聚集、改善微循环等作用。在临床上治疗缺血性脑血管疾病具有一定疗效［1］，但其作用机制尚未完全阐明。本实验观察川芎嗪对脑缺血再灌注后皮质Bax mRNA表达的影响，为缺血性脑血管病的防治提供新的思路。
       1  材料
       1.1  动物健康雄性Wistar大鼠30只,体重200~240 g，随机分为3组，每组10只。A组为正常对照组，B组为模型对照组,C组为川芎嗪治疗组。
       1.2  试剂  盐酸川芎嗪注射液购于北京市永康药业，生产批号为05030901。Bax mRNA原位杂交试剂盒购于武汉博士德公司，BaxmRNA探针序列：① 5"-CCACC  AGCTC  TGAGC   AGATC  ATGAA  GACAG-3"；② 5"-AGGAT  GCGTC  CACCA  AGAAG  CTGAG  CGAGT-3"； ③ 5"-AGCA  AACTG  GTGCT  CAAGG  CCCTG  TGCAC-3"。
       2  方法
       2.1  模型制作颈部正中切口，暴露和分离左右颈总动脉，自右颈总动脉远端逆行插管（并结扎近心端），将插管近心端插入右颈外静脉，然后用动脉夹夹闭左颈总动脉，使椎动脉进入脑中的血液经引流管进入右颈外静脉中，从而造成脑缺血，并开始腹腔注射川芎嗪，90 min后夹闭动、静脉引流管，开放左颈总动脉夹，导致脑缺血再灌注。再灌注24 h分别麻醉和处死动物，取脑［2］。
       2.2  标本采集和处理川芎嗪治疗组于腹腔注射给药(100㎎/㎏),模型对照组不给药,正常对照组不做处理。各组均断头取脑,在脑的视交叉后和下丘脑后横断(冠状面)将脑分为前中后三部分,在前中切面上取1.5 mm用于石蜡包埋,切片厚度5 μm。
       2.3  原位杂交操作程序严格按照试剂盒规定，其中消化时间为5 min，38℃水浴，预杂交3 h（38℃），杂交时间约16 h（38℃），DAB显色。光镜下观察细胞胞浆呈棕黄色者者为阳性细胞,否则为阴性,利用图像分析技术,对原位杂交切片进行分析,以胞质着色深度代表mRNA含量的变化,取平均灰度值,其值越小说明其阳性物质越多。
       2.4  统计学处理数据用±s表示，采用SPSS10.0软件进行统计学分析，组间χ2检验，P＜0.05为有显著性差异。
       3  结果
          
       模型对照组大脑皮质中Bax mRNA阳性神经元多、着色深，表现为平均数密度大，平均灰度值小；正常对照组中Bax mRNA着色浅，平均灰度值大，阳性细胞数少，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。治疗组与模型对照组比较阳性细胞平均数密度减小，平均灰度值增大，组间比较有明显差异（P＜0.05）。结果见表1~2。
       表1  脑缺血再灌注后脑皮质中Bax mRNA的表达（略）
       对照组A与模型组B、治疗组C比较，P＜0.05；治疗组C与模型组B比较，P＜0.05；n=10
       表2  脑缺血再灌注后脑皮质Bax mRNA的表达（略）
       对照组A与模型组B、治疗组C比较，P＜0.05；治疗组C再与模型组B比较，P＜0.05
       4  讨论
          
       脑缺血再灌注后可引起大量自由基产生，炎症介质过度表达，血液黏滞度增高，红细胞变形能力下降等等，均可影响脑部微循环，导致脑血管内皮细胞肿胀、凋亡或坏死，因此，保护脑部微循环的完整性对脑缺血的预后有重要意义［3］。在临床上采用抗凝、溶栓等传统治疗手段来增加大脑的血液供应，另外刺激脑内毛细血管生成有可能成为一种新的临床治疗手段［4］。
       
       脑缺血再灌注后神经元凋亡是细胞接受某种信号后一种主动的、由相关基因相互作用，以DNA早期降解为特征的自杀过程［5］。脑缺血再灌注后神经元与多种促/抑凋亡基因有关，原癌基因B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）基因家族中Bcl-2和Bax基因是反映细胞凋亡、但作用相反的一组重要调控基因。Bcl-2抑制细胞凋亡，Bax促进细胞凋亡。Bcl-2的过度表达可抑制自由基增加及神经生长因子缺乏等多种因素所致的神经细胞凋亡；而Bax可能通过与Bcl-2形成异源二聚体形式抑制Bcl-2的作用而促进细胞凋亡。因此Bcl-2/Bax的比值与细胞凋亡成反比［6］。
       
       川芎嗪是中药川芎的有效成分之一，在临床上对缺血性脑血管病有较好疗效。徐芝秀［7］研究表明，川芎嗪对脑缺血再灌注大鼠有改善血液流变性和保护脑组织的作用。另有学者［8］研究川芎嗪可上调脑缺血再灌注诱导的Bcl-2蛋白表达，同时下调Bax蛋白表达，使Bcl-2/Bax比值升高，促使Bax- Bcl-2异源二聚体形成，抑制凋亡。本研究显示，模型对照组大脑皮质中Bax mRNA阳性神经元多，着色深，表现为平均数密度大，平均灰度值小；正常对照组中Bax mRNA着色浅，平均灰度值大，阳性细胞数少，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。治疗组与模型对照组比较阳性细胞平均数密度减小，平均灰度值增大，组间比较有明显差异（P＜0.05），说明Bax基因在脑缺血再灌注中表达增强，发挥促进神经细胞的凋亡，川芎嗪可使脑缺血再灌注损伤中Bax mRNA表达下降，可抑制细胞凋亡，具有神经保护作用。
       
       川芎嗪可以抑制多形核细胞聚集黏附，减轻钙超载，阻止血小板聚集，清除自由基，保护线粒体的功能等。从而对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。本实验显示川芎嗪可抑制促凋亡基因Bax   mRNA的表达，阻止细胞凋亡，减轻脑缺血再灌注所致脑损伤。脑缺血再灌注损伤的病理生理是一个多环节、多因素、多途径损伤的酶促级联反应。该过程机制复杂，各机制间相互关联，多种药物的联合作用，相辅相成，从而有助于提高临床治疗效果。
       【参考文献】
         　　［1］ 戈继业，张振岭.川芎药理作用研究及临床应用新进展［J］.中国中西医结合杂志，1994，14（10）：638.
       
       ［2］ 赵秀美，刘育英，姜 澜,等.大鼠脑缺血及再灌流实验模型的应用与发展［J］.微循环学杂志，1997，7（4）：1.
       
       ［3］ Kningt RA，Nagesh V，Nagaraja TN，et al. Acute blood-brain barrier opering in experimentally induced focal cerrebral ischemia is preferentially identified by quantitative magnetization transfer imaging［J］.Magn Reson Med ,2005,54(4):822.
       
       ［4］ Jiu R, Wen Y, Perez E, et al. 17 beta-Estradiol attenuates blood-brain barrier disrution induced by cerebral ischemia-reperfusion injury in female rats［J］.Brain Res ,2005, 26(1):55.
       
       ［5］ 兰希发，姚文秀，郭 阳.脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的机制［J］.中国临床康复，2003，7（19）：2726.
       
       ［6］ Brambrink ，A M， Schneider A, Noga H , et al. Tolerance-inducing dose of 3-nitropropionic acid modulates bcl-2 and bax balance in the rat brain : a potential mechanism of chemical preconditioning［J］.J Cereb Blood Flow Metab,2005,20(10):1425.
       
       ［7］ 徐秀芝.川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］.实用中医药杂志,2007，23（7）：411.
       
       ［8］ 曲友直，赵燕玲，高国栋，等.川芎嗪对局灶性脑缺血再灌注后Bcl-2、Bax蛋白表达的影响［J］.中国康复，2005，20（6）：326.