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       【摘要】 
       目的观察滇产粗根荨麻水提取部分Urtica macrorrhiza Hand- Mazz，Ur对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages，PMφ）分泌前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2）水平及对体外LPS诱导PMφCOX-2 mRNA表达的影响，探讨其治疗类风湿性关节炎可能的作用机制。方法建立AA大鼠模型，Ur水提取部分连续灌胃给药14 d 或21 d后分次获取PMφ，LPS诱导PGE2的产生，用酶联免疫吸附法检测培养上清液中 PGE2水平。体外培养PMφ，RT-PCR方法检测LPS诱导COX-2 mRNA表达。结果Ur水提取部分（400，200 mg/kg）对LPS诱导的AA PMφ分泌PGE2水平有明显抑制作用。Ur(200 ，100 μg/ml)能显著抑制LPS诱导的COX-2 mRNA的表达。结论滇产粗根荨麻水提取部分对佐剂性关节炎的治疗作用可能与其抑制PMφ分泌PGE2及COX-2 mRNA表达有关。
       【关键词】  粗根荨麻 佐剂性关节炎 前列腺素E2 COX-2mRNA
       Effects of Aqueous Fraction of Urtica macrorrhiza Hand-Mazz on Production of PGE2 Release from Peritoneal Macrophages in Vivo and the Expression of COX-2 mRNA in Vitro
       LI Xiaohong,     LI Shunying,  ZHAO Yongna*,   Li Binglan ， SHAO Xiaoxia
       （Faculty of Pharmaceutical Sciences, Kunming Medical College,Kunming,Yunnan, 650031, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of aqueous fraction of Urtica macrorrhiza Hand- Mazz(Ur) on modulating prostaglandin E2(PGE2) production in vivo and the expression of COX-2 mRNA in vitro and elucidate the possible mechanisms of anti-inflammatory and anti-rheumatoid effects of Ur. MethodsAdjuvant arthritis(AA) rat was used as the model. The PMφ samples were taken at different time after medication. PGE2 level was measured by ELISA method. PMφ induced by lipopolysaccharide(LPS) was cultured in vitro, and the expression of COX-2 mRNA was detected by RT-PCR. ResultsUr(400 mg/kg and 200 mg/kg) could inhibit LPS induced PGE2  release from PMφ in AA rats. The expression of COX-2 mRNA induced by LPS was significantly increased. Ur(200 μg/ml and 100 μg/ml) could decrease the expression of COX-2 mRNA .ConclusionThe anti-inflammatory mechanisms of Ur in AA rats might be related to its inhibitory effects on the level of PGE2 from PMφ in vivo and the expression of COX-2 mRNA in vitro.
       Key words：Urtica macrorrhiza Hand- Mazz;   Adjuvant arthritis;   Prostaglandin E2;   COX-2 mRNA
       
       荨麻属植物在我国药用历史悠久，民间常用于祛风除湿，治疗风湿病。异株荨麻不同部位的提取物具有多种药理学活性，如抗炎、抗前列腺细胞增生、抗糖尿病及抗化学性肝损伤等作用［1，2］，异株荨麻叶提取物通过抗炎作用而用于治疗类风湿性关节炎，且副作用较小，并作为一种治疗风湿病的药物在德国生产上市［3］。川产荨麻多糖能明显抑制角叉菜胶所致大鼠足肿胀和二甲苯所致小鼠耳廓肿胀 ［4］；滇产粗根荨麻茎水粗提物及全草水提取部位能明显减轻角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀［5，6］。环氧合酶－2(cyclooxygenase-2，COX-2)是PGE2合成过程中的一个重要限速酶，它将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物，COX-2呈诱导性表达，它主要表达在巨噬细胞（macrophage，Mφ）、成纤维细胞、软骨细胞、上皮细胞、关节滑膜、肾小球致密斑等一些与炎症有密切关系的细胞或组织上，在炎症因子和/或细胞因子的刺激下大量表达，参与炎症反应的发生和发展，且其表达水平与炎症的严重程度相关［7］。在AA大鼠的关节滑液中富含大量的PGE2 ，是由于COX-2 mRNA 及蛋白在所累关节大量表达引起［8］。本实验观察Ur水提取部位对AA大鼠PMφ分泌PGE2 的影响及抑制PGE2分泌的可能作用机制。
       
       1    材料
       1.1  药品 滇产粗根荨麻采自云南武定县，经中科院昆明植物研究所鉴定；粗根荨麻全草，70％酒精提取后，回收酒精，分别用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取后的水部分，蒸干即得水提取部分；强的松（Prednisone acetate，Pre）5 mg/片，批号：060904;地塞米松磷酸钠注射液(Dexamethasone Sodium phosphate injection,Dex），批号061108，浙江仙踞制药有限公司；完全弗氏佐剂(Complete Freund"s adjuvant，CFA)，Sigma 公司，批号：075K8915；RPMI-1640培养基，美国Hyclone，批号Nrg0016。
       1.2  试剂小牛血清，新西兰，批号DQA0194；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS大肠杆菌来源），批号011:B4；台盼蓝，美国Sigma，批号T-0776；D-Hanks平衡盐，美国Sigma公司，批号016K8317。PGE2ELISA试剂盒，美国ADL公司； cDNA 合成试剂盒，日本Toyobo公司， FSK-100，2×Taq PCR Master Mix, 中国天威公司，批号KT 201；S-V Total RNA 提取试剂盒，美国 Promega公司，批号Tm048； MTT, 美国Xiasi生物公司，批号0793；酶标仪，美国 BIO-RD公司，505型。
       2  方法
       2.1   AA模型的建立［9］S-D 大鼠50只，体重180~200 g，雌雄各半，由昆明医学院实验动物中心提供，许可证号SCXK（滇2005-0008）。分为正常对照组（normal）；AA 模型组； Ur 400 mg/kg组；Ur 200 mg/kg组；阳性对照组(Pre)。正常组大鼠右后足垫皮内注入蒸馏水0.1 ml，其余各组大鼠右后足垫皮内注入CFA 0.1 ml。于致炎后7d开始灌胃给药， 受试药Ur水提取部分［（400，200 mg/ kg·d）］，阳性组给予Pre 5 mg/ （kg·d），连续给药14 d或21 d。
       2.2  大鼠腹腔巨噬细胞的制备和PGE2的诱生［10］分别于造模后21，28 d脱颈处死大鼠，75％酒精浸1 min，固定大鼠于无菌手术台，预冷的D-Hank"s液15 ml分次灌洗腹腔，获取PMφ，离心，完全RPMI－1640调整细胞浓度为2×106/ml，行细胞计数（台盼蓝染色示细胞活力＞95％），接种于96孔培养板中，每孔200 μl，37℃，5％CO2 培养箱培养2 h后，移除上清，去除不贴壁细胞，重新加入190 μl完全RPMI-1640培养液，加入0.1 mg/ml LPS10 μl，终浓度为5 mg/L，继续培养24 h后收集上清，－20℃保存待测。
       2.3  PGE2的测定  PGE2含量采用ELISA法测定，按试剂盒说明进行检测。
       2.4   体外细胞模型的制备按上述方法收集纯化正常大鼠PMφ ，完全RPMI－1640调整细胞浓度为2×106/ml，接种于24孔培养板中，每孔1 ml，加入Ur (50，100，200 μg/ml) 或Dex (25     μg/ml) 2h 后加入LPS 5 μg/ml继续培养24 h。
       2.5   MTT法测定细胞毒性［11］在96孔培养板上加入2×104/ml的细胞悬液（100 μl/孔），4 h贴壁纯化，加入完全RPMI-1640培养液90 μl后，分别加入Ur（4 000 ，2 000 ，1 000，500 ，200 ，100 ，50 ，25 μg/ml），均设8复孔。设立细胞对照孔、培养液对照孔，培养（37℃，5％CO2）48 h后，加入MTT溶液20 μl/孔；继续培养4 h后，加入三联液（10％SDS－5％异丁醇－0.012 mol/L HCl(W/V/V）100 μl/孔，于37℃放置过夜后，用酶标仪测各孔λ570 nm/λ630 nm的吸光度值。
       2.6  总RNA 的提取及RT-PCR按SV Total RNA Isolation System试剂盒说明提取总RNA， ODλ260nm/ODλ280 nm 比值介于1.6~2.0之间。cDNA 按照试剂盒说明合成， 引物参照文献设计［12］，COX-2引物为：上游：5"-CCA TGT CAA AAC CGT GGT GAA TG-3"；下游：5"-ATG GGA GTT GGG CAG TCA TCA G-3"，产物长度为374 bp； G3PDH引物：上游：5"- ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3"；下游：5"-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3"，产物长度为452 bp；Matermix PCR试剂盒进行PCR扩增，扩增条件如下：PCR反应条件：95℃，2 min；95℃，1 min；60℃，45 s；72℃延伸1 min，扩增38个循环；72℃延伸8 min。
       2.7   PCR产物定量PCR扩增产物（6 μl）经1%琼脂糖凝胶电泳，GIO-PRO Analyzer凝胶成像系统及定量分析软件进行分析，以COX-2 PCR产物与内参照管基因（G3PDH） PCR产物的光密度值之比作为COX-2 mRNA的相对表达量值。
       2.8   统计学方法所有数据用±s表示，应用SPSS11.5软件进行方差分析。P<0.05表示为有显著性差异。
       3  结果
       3.1   Ur水提取部分对LPS诱导AA大鼠PMφ分泌PGE2水平的影响 从表1可以看出，AA大鼠PMφ分泌PGE2明显增高。Ur水提取部分（200，400 mg/kg）给药14 d及21 d均可抑制AA大鼠PMφ分泌PGE2水平，与模型组比较（P<0.01）。
       3.2   MTT法检测细胞毒性结果
       
       抑制率（%）＝（OD细胞对照组－OD待测药物组）/（OD细胞对照－OD空白对照（培养液））×100％
       
       实验结果表明，Ur不同浓度对PMφ的生长无明显抑制作用。
       3.3   Ur对体外LPS诱导PMφCOX-2 mRNA 表达的影响RT-PCR结果显示LPS能明显诱导PMφCOX-2 mRNA的表达, 与正常组比较（P<0.01）。Ur 200 μg/ml显著性降低LPS诱导COX-2 mRNA的表达，与LPS组比较（P<0.01），Ur 100 μg/ml能明显降低LPS诱导COX-2 mRNA的表达，与LPS组比较（P<0.05），Ur 50 μg/ml可降低LPS诱导COX-2 mRNA的表达，但与LPS组比较（P>0.05）。见表2及图1~2。
       表1粗根荨麻水提取部分对LPS诱导AA大鼠PMφ分泌PGE2水平的影响（略）
       与模型组比较，**P<0.01；n=5
       表2  粗根荨麻水提取部位对LPS诱导大鼠PMφCOX-2mRNA表达的影响（略）
       与LPS组比较,*P＜0.05，**P＜0.01；n=4
       图1  COX-2及G3PDH RT-PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳图（略）
       图2  粗根荨麻水提取部位对LPS诱导大鼠PMφCOX-2 mRNA 表达的影响（略）
       4  讨论
          
       类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是免疫介导的慢性炎症性疾病。主要病理特征是滑膜细胞增生，衬里增厚，多种炎性细胞浸润，血管翳形成，以及软骨和骨组织的破坏。RA中的滑膜细胞、淋巴细胞、巨噬细胞处于高度活化状态，可合成IL-1β、PGE2及TNF-α等多种炎性细胞因子［12］。PGE2在RA局部炎性关节腔内和血液循环中增加，可引起局部关节炎症反应性水肿、渗出、红肿和疼痛，刺激滑膜血管翳形成，从而加重滑膜炎症，并引起软骨破坏。
       
       环氧合酶－2(cyclooxygenase-2，COX-2)是PGE2合成过程中的一个重要限速酶。一般认为，COX-2是呈诱导性表达，通常不表达或低表达，在TNF-α、IL-1β及其他细胞因子的刺激下会在巨噬细胞、滑膜细胞、软骨细胞等中高表达，导致PGE2 分泌增多［13，14］并诱发炎症反应。COX-2 基因对于自身免疫性关节炎的发病是必须的［15］，抑制COX-2的表达，可减少PGE2的产生，从而减轻炎症反应。
       
       Ur水提取部分可以抑制AA大鼠关节肿胀度，并降低关节炎指数［16］，在本实验中，AA大鼠用来观察Ur 体内对 LPS诱导PGE2的作用。培养PMφ观察Ur 体外对LPS诱导COX-2 mRNA的作用。实验中观察到，AA大鼠PMφ分泌PGE2含量明显增高，在连续灌胃给药14 d及21 d，Ur水提取部分可显著性抑制PGE2分泌水平。体外实验，RT-PCR结果表明，Ur 明显抑制COX-2 mRNA 的表达，并呈剂量依赖性。提示Ur 对AA大鼠体内PGE2合成的抑制作用可能是通过降低COX-2 mRNA 的表达而发挥抗炎作用的。
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