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       【摘要】 
       目的研究大豆异黄酮对去卵巢大鼠阴道上皮Bcl-2和Bax表达的影响。方法选择Wistar大鼠50只，随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、大豆异黄酮高剂量组和大豆异黄酮低剂量组，每组10只，给药6周后处死大鼠，分离摘取阴道，常规石蜡包埋，切片进行HE染色及免疫组化凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果大豆异黄酮能使去卵巢大鼠阴道的重量增加，上皮增厚，但作用弱于雌激素。模型组、阳性药物对照组、大豆异黄酮高剂量组、大豆异黄酮低剂量组Bcl-2的灰度值分别为57.692±4.49，116.847±9.95，101.345±5.87，109.56±9.11。Bax分别为168.049±11.43，106.49±9.58，121.34±15.78，119.82±20.89。结论大豆异黄酮可促进阴道上皮Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达。
       【关键词】  去卵巢大鼠 大豆异黄酮 阴道 Bcl-2 Bax
       Effect of  Soy Isoflavon on the Expression of Bcl-2 and Bax in the Vagina of Ovariectomy Rats
       SUN Xiaofang， HAN Yanmei, DUAN Fei, SONG Jie, KOU Suru
       （Medical School, Hebei University，Baoding, Hebei， 071000 China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of soy isoflavon on the expression of Bcl-2 and Bax in the vagina of the ovariectomy rats.MethodsIn this study，50 adult female wistar rats were divided into 5 groups: sham-operated group(10 rats), model group(10 rats), estrogen group (10 rats), high dose soy isoflavon group(10 rats)and low dose soy isoflavon group(10 rats) .After 6 weeks，all rats were killed and the vagina was excised. The vaginal tissue in each group was studied with HE and immunohistochemistry. ResultsSoy isoflavon could increase the weight and the thickness of vagina，but the effect was less intensity than estrogen. The gray values of Bcl-2 in model group, estrogen group, high dose soy isoflavon group and low dose soy isoflavon group were 57.692±4.49,116.847±9.95,101.345±5.87,109.56±9.11,respectively. Baxes were 168.049±11.43,106.49±9.58,121.34±15.78,119.82±20.89,respectively.ConclusionSoy isoflavon has estrogen action. It can increase the expression of Bcl-2 and reduce the expression of Bax in vagina.
       Key words：Ovariectomy rats；  Soy isoflavon；  Vagina ；  Bcl-2；  Bax
       
       女性绝经以后，由于卵巢功能停止，激素代谢紊乱，引起绝经期综合征，目前临床上多采用激素替代疗法进行治疗。但激素替代治疗可出现不规则的阴道出血，增加患子宫内膜癌及乳腺癌的潜在危险，从而使得激素替代治疗受到限制。
       
       植物雌激素包括异黄酮、木脂体和香豆雌酚三大类，其结构与雌激素相似，为杂环多酚类化合物，能与雌激素受体结合发挥微弱的雌激素效应。而大豆异黄酮在具有雌激素作用的同时，还具有抗雌激素作用，可以减少子宫内膜癌的发生几率。有关雌激素促进Bcl-2蛋白表达的研究报道较多，但大多集中在脑缺血区［1］、子宫内膜［2］、心内神经节［3］等区，尚未见到有关影响阴道中Bcl-2和Bax蛋白表达的报道。因此本实验比较观察大豆异黄酮和雌激素对阴道凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达的影响，以进一步探讨大豆异黄酮的作用机理，从而为临床应用提供理论依据。
       1  材料
          
       雌二醇，北京四环制药厂出品，批号20060403。大豆异黄酮，兔抗大鼠Bcl-2和Bax抗体，羊抗小鼠二抗，DAB显色剂均为北京中山生物技术有限公司生产。
       2  方法
       2.1  动物及分组  Wistar雌性大鼠50只，随机分为5组，每组10只，即假手术组、模型组、阳性对照组(雌二醇组)、大豆异黄酮高剂量组和大豆异黄酮低剂量组。
       2.2  造模 除假手术组外，其余各组大鼠将双侧卵巢摘除，假手术组的大鼠重复手术步骤，但不摘除卵巢。具体手术步骤为：用1.5%戊巴比妥(2.5 ml/kg)将大鼠腹腔麻醉，仰卧固定于手术台，取腹正中切口，切开皮及肌肉层1~1.5 cm，用镊子深入切口处，可拽出一发亮的脂肪团，其内可见双角管状子宫，沿子宫可找到卵巢，为深红色，将双侧卵巢摘除止血，再将牵拉出的输卵管及子宫轻轻放回腹腔，缝合腹肌和皮肤，术后肌肉注射少量青霉素。
       2.3  给药方法 手术后，各组大鼠正常饮食1周，第2周开始给药，持续6周，模型组和假手术组每日生理盐水灌胃；阳性对照组，每日灌胃给予雌二醇6 g/（100 g·d）；大豆异黄酮低剂量组，按所含黄酮量计算，灌胃60 mg/（100 g·d）；大豆异黄酮高剂量组，灌胃300   mg/（100 g·d）。
       2.4  动物取材 造模后6周，用1.5%戊巴比妥(2.5ml/kg)将大鼠腹腔麻醉，剪开大鼠腹正中线，将阴道与周围脂肪组织完全剥离称重，新鲜组织用中性甲醛固定后制成石蜡切片，常规HE染色观察组织形态学变化。
       2.5   免疫组织化学染色及定量分析免疫组织化学染色采取SABC法，石蜡切片脱蜡至水后入0.03%甲醇-H2O2室温孵育30 min，以封闭内源性过氧化物酶；分别用兔抗大鼠Bcl-2和Bax抗体(Santa cruz，1：200)孵育切片(4℃，过夜)；再用生物素化的羊抗小鼠二抗孵育30 min，37℃；DAB显色5~10 min。每步骤间用0.01 mol/L PBS充分洗涤，常规脱水、透明、封片，镜下观察、摄片。对照实验：省去一抗或用正常羊血清代替一抗孵育切片,结果为阴性。
       
       使用通用医学图像分析仪(TN-8502)，镜下观察各组染色结果，测定细胞灰度值，用OS-9数据分析软件分析相应抗体的表达量。每组取5张切片，每张切片选5个视野，其平均值为该张切片的灰度值。各组数据采用±s表示，应用SPSS 10.0分析，P<0.05为有显著性差异。
       3  结果
       3.1  大鼠阴道湿重测量结果见表1。
       表1  大鼠阴道湿重结果（略）
       与假手术组比较，△P﹤0.01；与模型组比较，*P﹤0.05,**P﹤0.01；n=10
       3.2  阴道组织形态学观察假手术组的阴道三层结构清晰，黏膜形成许多横行皱襞，黏膜表面为未角化的复层扁平上皮，黏膜固有层内含有丰富的血管，并可见弥散淋巴组织或淋巴小结；模型组大鼠阴道壁变薄，横行皱襞减少，黏膜表面的未角化复层扁平上皮细胞层数明显减少，固有层内的血管减少；阳性药物组大鼠阴道壁增厚，黏膜固有层内含有丰富的血管，与假手术组无明显差异；大豆异黄酮高低剂量组阴道壁亦有所增厚，两组之间无明显差异，但均比假手术组薄，而比模型组厚。
       3.3  大豆异黄酮对去卵巢大鼠阴道Bcl-2和Bax的影响镜下观察Bcl-2蛋白免疫组化阳性染色细胞的棕黄色颗粒，灰度分析结果显示，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠阴道上皮细胞平均灰度值降低（P<0.05），说明模型组大鼠的抑凋亡基因bcl-2表达减弱。雌激素和大豆异黄酮高剂量组和低剂量组均可不同程度地升高去卵巢大鼠阴道上皮细胞Bcl-2蛋白的平均灰度值(P<0.01或P<0.05)。见表2。这一结果说明，去卵巢可以使大鼠阴道上皮细胞Bcl-2蛋白表达减弱，雌激素和大豆异黄酮可促进去卵巢大鼠Bcl-2蛋白表达，从而发挥抑制大鼠阴道细胞凋亡的作用。
       表2  Bcl-2在各组大鼠阴道上皮细胞中表达的比较（略）
       与假手术组比较，△P﹤0.01；与模型组比较，*P﹤0.05,**P﹤0.01；n=25
       
       镜下观察Bax蛋白免疫组化阳性染色细胞的棕黄色颗粒，灰度分析结果显示，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠阴道上皮细胞平均灰度值升高（P<0.05），说明模型组大鼠的促凋亡基因Bax表达增强。雌激素和大豆异黄酮高剂量组和低剂量组均可不同程度地降低去卵巢大鼠阴道上皮细胞Bax蛋白的平均灰度值(P<0.05)。见表3。这一结果说明，去卵巢可以使大鼠阴道上皮细胞Bax蛋白表达增强，雌激素和大豆异黄酮可抑制去卵巢大鼠Bax蛋白表达，从而发挥抑制大鼠阴道细胞凋亡的作用。
       表3  Bax在各组大鼠阴道上皮细胞中表达的比较（略）
       与假手术组比较，△P﹤0.01；与模型组比较，*P﹤0.05,**P﹤0.01；n=25
       4  讨论
          
       妇女绝经后，由于卵巢功能衰退，雌激素分泌减少，相应的引起生殖道的变化，使子宫萎缩，阴道上皮变薄，表皮细胞数目变少。
       
       Bcl-2和Bax是与凋亡密切相关的蛋白质，其作用是相互拮抗的［4］。它们通过蛋白-蛋白的相互结合与解聚作用主宰着细胞的存活与凋亡。当Bcl-2大量表达时，形成Bcl-2同源二聚体，细胞受到保护；当Bax大量表达时，形成Bax同源二聚体，细胞趋向凋亡。
       
       本实验结果显示去卵巢可以使抑凋亡蛋白Bcl-2的表达明显降低，促凋亡蛋白Bax的表达增强，雌二醇和大豆异黄酮高剂量组和低剂量组均可不同程度地促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，说明大豆异黄酮抑制去卵巢大鼠阴道上皮细胞凋亡与调控凋亡抑制基因Bcl-2和促凋亡基因fas的表达有关。本实验为揭示雌激素类药物的作用机制提供了基础资料。
       【参考文献】
         　　［1］ 杨卫民,周 农,汪 凯,等.雌激素对雄性大鼠缺血性脑损伤的神经保护作用及其可能机制［J］.临床神经病学杂志,2005,18(4):250.
       
       ［2］ 徐 霞,刘美莲,卢 瑾,等.长期雌激素替代治疗对大鼠子宫内膜Bcl-2和H-ras基因与蛋白表达的影响［J］.中南大学学报(医学版),2005,30(1):41.
       
       ［3］ 陈小武,祝善乐,范玉华,等.雌激素对卵巢摘除大鼠心内神经节细胞Bcl-2和Bax表达的影响［J］.神经解剖学杂志,2004,20(5):509.
       
       ［4］ 哈灵侠,张绍芬,谢 倩,等.更年期大鼠血清雌二醇水平与脾细胞凋亡的增龄性改变［J］.复旦学报(医学版)，2004，31(2): 155.