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       【摘要】 
       目的对几种中药进行了植物雌激素的活性筛选。方法采用人乳腺癌细胞增殖法与酵母菌雌激素筛检实验法对9种中药进行了植物雌激素活性的研究。结果成功地建立了E-SCREEN法与Yeast Estrogen Screen实验法，此两种方法均可检测到1×10-13 mol/L的雌二醇。在这两种体外雌激素活性筛选实验条件下，当归、泽泻、川芎、牡丹皮、桂枝均有雌激素活性；而茯苓、桃仁则无雌激素样活性。结论E-SCREEN法敏感性高，并有快速、简便等优点，适用于大量化合物的初选。
       【关键词】  人乳腺癌细胞增殖法 酵母菌雌激素筛检实验 雌激素活性
       Experimental Study on Estrogenic Activities of Nine Kinds of Chinese Herbal Medicines
       PALIDA Abulizi,RANA Kasimu, SHENG Ping,CONG Yuanyuan,MASSO Hattori
       (College of Pharmacology, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054,China;College of Traditional Chinese Medicine, Urumqi 830054,China;Toyama Medical and Pharmaceutical University 2630 Sugitani Toyama,930-0194，Japan)
       Abstract：ObjectiveTo evaluate  the estrogenic activity of several kinds of Chinese herbal medicines. MethodsE-Screen and Yeast Estrogen Screen technology were used to study the estrogenic activity of nine Chinese herbal medicines. ResultsThe two methods detected estradiol at very low concentration  as 1×10-13mol/L. It was found that Angelica acutiloba Kitagawa var.sugiyamae Hikono.,Alisma orientale Juzepczuk.,Cnidium officinale Makino.,Paeonia suffruticosa Andr.,Cinnamomum cassia Blume. had estrogenic effects, while Poria cocos wolf.and Prnus persica Batsch. lacked estrogenic effects at this assay.ConclusionThe E-SCREEN test is sensitive, rapid and easy to perform.It"s suitable for large-scale screening for estrogenicity of environmental chemicals.
       Key words：E-SCREEN;   Yeast Estrogen Screen;   Estrogenic activity
       
       植物雌激素（phytoestrogen，PE）根据分子结构的不同主要包括5类:黄酮类、木脂素类、香豆素类、二苯乙烯类、真菌等［1］。通过人乳腺癌细胞系MCF-7［2］检测雌激素活性的方法及酵母菌雌激素筛检试验法（Yeast Estrogen Screen）［3］对茯苓是否具有植物雌激素作用进行了研究。
       
       MCF-7人乳腺癌细胞是最常用的检测雌激素样活性的细胞株，Soto最早从雌激素依赖的转移性乳腺癌分离并建株。在此后的研究中，发现该细胞含有雌激素受体，在雌激素作用下增殖，而且只对雌激素样物质产生效应，对其它非雌激素样化学物无效，Soto等把它检验雌激素的方法，并称为E-screen实验。酵母菌雌激素筛检实验目前最常见的是应用转染了hERcDNA和与编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因相连的雌激素反应元件（ERE）的S.cerevisiac菌株。当经过E2或外源性雌激素处理后，YES系统中β-半乳糖苷酶活性显著增加。本研究中应用E-screen实验和酵母菌雌激素实验法对茯苓等中药进行了雌激素活性筛选研究。
       1  材料
       1.1  药物  当归Angelica acutiloba Kitagawa var.sugiyamae Hikono.(日本北海岛);川芎Cnidium officinale Makino.; 桂皮 Cinnamomum cassia Blume.; 桃仁 Prnus persica Batsch.;泽泻 Alisma orientale Juzepczuk.;茯苓Poria cocos wolf.白术Atractylodes  japonica Koidzumi ex  Kitamura.; 芍药Paeonia lactiflora Pallas.; 牡丹皮Paeonia suffruticosa Andr.（购于日本药局方）。各药材分别用10倍量水煮提两次，过滤，合并滤液并减压浓缩，真空干燥后配制成1mg/ml的水提液。
       1.2  试剂  EMDM培养基、无酚红EMDM培养基、17β-雌二醇、β-半乳糖苷酶、S.cerevisiac酵母菌株、SD培养基、Zymolase试剂（为Sigma公司产品），邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG，日本和汉药研究所提供），胎牛血清（FBS，日本和汉药研究所提供），其余试剂均为日本产分析纯。
       1.3   仪器电子读数分析天平(日本 Shimaduz 公司)；二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)；倒置显微镜(日本Olympus)；台式高速低温离心机(美国Becton Dickinson公司)；全温振荡培养基(美国Becton Dickinson公司)；BIO-RAD Model 3550-UV紫外分光光度仪(日本SANYO公司)；25 mm2培养瓶、96孔培养板（美国Becton Dickinson）。
       2  方法
       2.1  细胞株及培养条件  雌激素敏感的MCF-7人乳腺癌细胞由日本和汉药研究所提供。以含5%胎牛血清（Hyclone）的DMEM培养基培养传代。培养条件：37℃，5%CO2，相对湿度95%。
       2.2  人血清中甾体激素的去除成年人血清购于Sigma公司,按E-screen法去除其中的甾体激素［4,5］。
       2.3  细胞增殖实验按E-screen法［5］并稍作修改，普通培养的MCF-7细胞经胰蛋白酶消化后以104个细胞/ml接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μl，贴壁24h后去除原培养基，换成实验用培养基：无酚红的DMEM基加10%热灭活的无雌激素人血清。继续培养5 d，此时加入阳性（雌二醇）对照组设10-13～10-9mol/L 5个浓度，不同浓度的受试物和阴性（溶剂）对照组，每个浓度设6个复孔。6 d后弃上清液，每孔加5 mg/ml的四唑盐（MTT）30 μl，继续培养4 h。吸去孔中的培养液，每孔加入150 μl的DMSO，在540 nm波长测定吸光度并计算增殖率，结果见表1。
       2.4  酵母菌株和培养基的建立  过夜培养的酵母转种至新的SD液体培养基中，加入不同浓度的植物提取物，于30℃恒温振荡器中培养4h，然后在595 nm测定吸光度。
       2.5  β-半乳糖苷酶活性的测定  测定并记录培养液的OD595，离心，弃取上清液，加入Zymolase 溶液，置37℃水浴中培养15 min，再加入ONPG溶液，置30℃水浴中培养30 min，加入1MNa2CO3100 μl终止反应。在450，540 nm波长测定吸光度，并计算β-半乳糖苷酶活性（U）值。结果见表1。
       
       （U）值=1000×（A450－1.75×A540）(ONPG反应时间t×0.05×A595)
       2.6  统计处理  所有数据均为3个重复的平均值，并表示为平均值(±s)。利用Dunnett′s 进行统计处理。
       表1  9种中药对MCF-7细胞增殖与酵母菌筛检实验的影响（略）
       3  结果
       3.1  9种中药对MCF-7细胞的增殖阳性对照(雌二醇)从浓度10-13～10-9mol/L对MCF-7人乳腺癌细胞增殖力与对照组相比均有显著性,并在10-10mol/L组实验对MCF-7细胞增殖力最强,与其它各组相比差异有显著性。说明本次实验结果是可靠的。各剂量组结果显示，高剂量川芎和牡丹皮对细胞的增殖率与空白组相比有显著性差异（P﹤0.01），当归和泽泻有差异；高剂量和低剂量芍药和白术对细胞的增殖率与空白组相比有差异（P﹤0.05）；低剂量川芎和牡丹皮有差异。
       3.2  酵母菌雌激素筛检实验结果显示当归、泽泻在高剂量和低剂量使β-半乳糖苷酶活性与空白组相比有显著性差异（P﹤0.01）；高剂量川芎、桂枝使β-半乳糖苷酶活性与空白组相比有差异（P﹤0.05）；低剂量牡丹皮使β-半乳糖苷酶活性与空白组相比有差异（P﹤0.05）。
       3.3   茯苓等9种中药的体外雌激素活性被检样品中当归、泽泻、川芎、牡丹皮、桂枝中均有体外雌激素活性，芍药和白术在MCF-7细胞增殖实验中有活性，茯苓和桃仁均未检出有体外雌激素活性。至于何种成分具有植物雌激素作用，需进一步进行化学成分的研究。
       4  讨论
          
       本实验成功地引入了人乳腺癌细胞（MCF-7）体外增殖法快速筛检中药雌激素的方法。实验中雌二醇的最低检测浓度为1×10-13mol/L，在1×10-10mol/L可引起MCF-7细胞的明显增殖，增殖率为255%，与酵母菌雌激素筛检实验相比，该实验的敏感性更高。建立稳定的方法后，检测周期只需要6 d，且操作简便，不需要复杂的仪器设备，适合于大量化合物的初选。实验所用的细胞和血清都来自人类，结果可能更好地外推至人类。
       
       有机体是一个复杂的体系,体外实验结果最终仍需整体动物实验加以验证,结果才能更加准确可靠。
         
       国内外文献中植物雌激素活性检测的方法主要采用经典动物实验法(子宫增重、阴道细胞角化法)，受多种因素影响，结果较粗糙，且不同研究者会得出不同的结论，如丹参、川牛膝、鹿茸等中药有的学者认为含雌激素活性而另一些学者却认为不含植物雌激素活性，因此在目前尚无灵敏度高和特异性强的检测方法的情况下，可以考虑多种方法的联合使用，以免得出错误的结论。
       【参考文献】
         　　［1］ 唐传核，杨晓泉，彭志英. 植物雌激素研究概况（Ⅰ）——化学结构，分类以及在食品中的含量［J］.中国食品添加剂，2002，3：43.
       
       ［2］ Zava DT. Estrogenic bioactivity of phytoestrogens in human breast cancer in monolager cluturre［J］. J Nutr, 1995, 125: 807.
       
       ［3］ Routledge EJ，Sumpter JP. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen ［J］.Environ Toxicol Chem, 1996, 15: 241.
       
       ［4］ Soto A M,Michandlson C L,Prechtl N V,et al. Assays to measure estrogen and androgen agonists antagonists［J］.Adv Exp Med Biol, 1998, 444(1)：9.
       
       ［5］ Soto A M, Lin T M,Justicia H, et al. An "inculture"bioassay to assess the estrogenicity of xenobioies［A］.In:Colbom T,Chemically Induced Alterations in Sexual development:the wildlifeHuman connection, Prinection Scientfic Publishing, Prinecton,NJ.1992：295.