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       【摘要】 
       目的研究广西产美味猕猴桃根抗肿瘤活性部位。方法利用系统溶剂分离法，对美味猕猴桃根进行部位分离，对其70％乙醇总提取物、石油醚提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物和95%乙醇提取物采用MTT法测定它们各自对宫颈癌细胞株Hela,人胃癌细胞株SGC7901，黑色素瘤细胞株B16，人肝癌细胞株Hele7404，小鼠肉瘤细胞株S180和小鼠肝癌细胞株H226种瘤株的生长抑制情况。结果美味猕猴桃根的70%乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对6种瘤株有明显的抑制作用。结论美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物具有一定的体外抗肿瘤作用。
       【关键词】  广西产美味猕猴桃根 抗肿瘤作用 活性部位
       Studies on the Antitumor Active Fraction of Roots of Actinidia deliciosa C.F.Liang et A.R.Ferguson in Guangxi
       LIANG Jie， ZHEN Hanshen， ZHANG Weiwei， LI Wulai， WANG Xinsheng， HUANG Tuanxin
       (Faculty of Pharmacology, Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530001, China)
       Abstract:ObjectiveTo study the antitumor active fraction of roots of Actinidia deliciosa C.F.Liang et A.R.Ferguson in Guangxi.MethodsThe chemical constituents of roots of Actinidia deliciosa were extracted and isolated by systematic solvents. The 70% alcoholic extracts were divided into four portions including petroleum ether extract，ethyl acetate extract，n-Butyl alcohol extract and 95% alcoholic extract. Antitumor experiment of different extracts in vitro was done by MTT assay on human uterine carcinoma Hela，human gastric adenocarcinoma SGC7901，B16 melanoma cell，human hepatoma Hele7404，mouse entity tumor S180 and hepatoma H22. ResultsThe growth of all tumor cells were inhibited by 70% alcoholic extract, ethyl acetate extract and n-Butyl alcohol extract from roots of Actinidia deliciosa. Conclusion70% alcoholic extract, ethyl acetate extract and n-Butyl alcohol extracts have some antitumor effects in vitro.
       Key words:Actinidia deliciosa C.F.Liang et A.R.Ferguson in Guangxi；  Antitumor effect；  Active fraction
       
       美味猕猴桃Acitinidia deliciosa C.F.liang et A.R.Ferguson为猕猴桃科猕猴桃植物。有实验表明，美味猕猴桃根乙醇提取物具有体外抑制肿瘤细胞生长和保肝作用［1~4］。为了进一步明确美味猕猴桃根的抗肿瘤活性部位，本文通过采用MTT法测定广西产美味猕猴桃根70％乙醇总提取物、石油醚提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物和95%乙醇提取物对宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、人肝癌细胞株Hele7404、小鼠肉瘤细胞株S180和小鼠肝癌细胞株H226种瘤株的生长抑制情况，研究美味猕猴桃根提取物的体外抗肿瘤作用。
       1  器材
       1.1  受试药物美味猕猴桃根采于广西桂林地区（资源县），经中国科学院广西植物研究所植物分类室鉴定为猕猴桃科猕猴桃属植物美味猕猴桃Actinidia deliciosa C.F.Liang et A.R.Ferguson。将新鲜的美味猕猴桃根晒干，粉碎为粗粉，称取药材粗粉，用70%乙醇回流提取3次，2 h/次，合并提取液，减压浓缩，得总提物。用硅胶拌匀后，依次用石油醚（60～90℃）、醋酸乙酯、正丁醇、95％乙醇回流提取，回收溶剂，得石油醚提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物、95％乙醇提取物。各提取物均用含有DMSO的培养液溶解，均配成浓度为4 mg/ml的溶液，置于-20℃冰箱密闭避光保存。临用前用不含血清和抗生素的RPMI1640液对倍稀释至所需浓度，DMSO终浓度在0.01%水平。
       1.2  RPMI完全培养液含RPMI1640培养基（GIBCO），3%谷氨酰胺，卡那霉素750 μg/ml,10%FBS（临用前加）。
       1.3  细胞株宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16均购自上海细胞生物研究所细胞库；人肝癌细胞株Bele7404由广西医科大学药理教研室提供；小鼠肝癌细胞株H22；由广西中医药研究院提供；小鼠肉瘤细胞株S180广西中医学院药学院药理学教研室保存。
       1.4  试剂MTT（四甲基噻唑蓝）为德国Sigma公司产品，批号：040809；FBS（胚胎牛血清）为美国Hyclone公司产品，批号：050512；RPMI1640培养基为GIB-CO公司产品，批号：1120708；Trypsin（胰蛋白酶）由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供，批号：200503；DMSO（二甲基亚砜）由天津汇英化学试剂有限公司提供，批号：20050628。
       1.5  细胞培养肿瘤细胞用含10%灭活新生小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，10%CO2条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。
       1.6  仪器Thermo Forma型CO2培养箱，美国产；Olympus型倒置显微镜，日本产；Biocell型酶标仪，奥地利产；AG135型电子天平，瑞士产；培养瓶，美国产；3072型96孔板，丹麦产；3001型培养皿，美国产；DLF560型超净工作台，荷兰产；HV-50自动高压灭菌器，日本产。
       2  方法
       2.1  MTT法取对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶消化后，用培养液稀释。在96孔培养板中每孔加入200 μl（含有5 000个/ml肿瘤细胞）含10%FBS的RPMI1640培养液，细胞置37℃，10%CO2培养24 h后，70%乙醇总提物、石油醚提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物、95%乙醇提取物5个实验组分别加入最终浓度为50，100，200 μg/ml提取物的培养液，空白对照组则加入等体积溶剂的培养液，每组4孔，置37℃，10%CO2培养5 d后，弃去上清液，加入200 μl/孔新鲜配制的含0.2 mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h，弃上清液，加入200 μl DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长570 nm，参比波长450 nm测定OD值，重复4次，按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率［5］，肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。并采用直线回归法计算半数抑制浓度IC50［6］。
       2.2  统计学处理计量资料以±s表示，多组均数间比较用F检验，两组间均数差异以SPSS 11.5 for windows统计软件进行t检验。
       3  结果
       3.1  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对宫颈癌细胞株Hela的抑制作用结果见表1~2。
       表1  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对宫颈癌细胞株Hela抑制作用（略）
       与空白组比较，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；n=4
       表2  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对宫颈癌细胞株Hela生长抑制率与药液浓度的相关性（略）
       Y-抑制率，X-浓度，r-相关系数，Y=AlgX+B
       
       由表1可见，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对宫颈癌细胞株Hela生长有直接的抑制作用。表2显示，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对宫颈癌细胞株Hela生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以直线回归法求得提取物的IC50。
       3.2  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对人胃癌细胞株SGC7901抑制作用结果见表3~4。
       表3  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对人胃癌细胞株SGC7901抑制作用（略）
       与空白对照组比较，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；n=4
       表4  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对人胃癌细胞株SGC7901生长抑制率与药液浓度的相关性（略）
       Y-抑制率，X-浓度，r-相关系数，Y=AlgX+B
       
       由表3可见，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对人胃癌细胞株SGC7901生长有直接的抑制作用。表4显示，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对人胃癌细胞株SGC7901生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以直线回归法求得提取物的IC50。
       3.3  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对黑色素瘤细胞株B16的抑制作用结果见表5~6。
       表5  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对黑色素瘤细胞株B16抑制作用（略）
       与空白对照组比较，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；n=4
       表6  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对黑色素瘤细胞株B16生长抑制率与药液浓度的相关性（略）
       Y-抑制率，X-浓度，r-相关系数，Y=AlgX+B
       
       由表5可见，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对黑色素瘤细胞株B16都有直接抑制作用。表6显示，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对黑色素瘤细胞株B16生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以直线回归法求得提取物的IC50。
       3.4  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对人肝癌细胞株Bele7404的抑制作用结果见表7~8。
       表7  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对人肝癌细胞株Bele7404抑制作用（略）
       与空白对照组比较，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；n=4
       表8  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对人肝癌细胞株Bele7404生长抑制率与药液浓度的相关性（略）
       Y-抑制率，X-浓度，r-相关系数，Y=AlgX+B
       
       由表7可见，美味猕猴桃根不同溶剂提取物对人肝癌细胞株Bele7404的抑制作用均较弱。表8显示，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物和正丁醇提取物对人肝癌细胞株Bele7404生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以直线回归法求得提取物的IC50。
       3.5  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对小鼠肉瘤细胞株S180的抑制作用结果见表9~10。
       
       由表9可见，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对小鼠肉瘤细胞株S180都有抑制作用，只有95％乙醇提取物对小鼠肉瘤细胞株S180的生长抑制作用较弱。表10显示，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对小鼠肉瘤细胞株S180生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以直线回归法求得提取物的IC50。
       表9  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对小鼠肉瘤细胞株S180抑制作用（略）
       与空白对照组比较，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；n=4
       表10  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对小鼠肉瘤细胞株S180生长抑制率与药液浓度的相关性（略）
       Y-抑制率，X-浓度，r-相关系数，Y=AlgX+B
       3.6  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对小鼠肝癌细胞株H22的抑制作用结果见表11~12。
       表11  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对小鼠肝癌细胞株H22抑制作用（略）
       与空白对照组比较，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；n=4
       
       由表11可见，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物和95％乙醇提取物对小鼠肝癌细胞株H22都有抑制作用。表12显示，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物和95％乙醇提取物对小鼠肝癌细胞株H22生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以直线回归法求得提取物的IC50。
       表12  美味猕猴桃根不同溶剂提取物对小鼠肝癌细胞株H22生长抑制率与药液浓度的相关性（略）
       Y-抑制率，X-浓度，r-相关系数，Y=AlgX+B
       4  讨论
          
       随着分子肿瘤学研究的不断深入，体外抗肿瘤实验已成为抗肿瘤药物研发过程中必不可少的一种方法。本实验选择了噻唑蓝法（MTT法）。该法是1983年由Mosmann在免疫学研究中应用于鼠淋巴细胞系研究IL-2等细胞因子对细胞存活和增效的影响而建立的方法［7］，随后，Denizot和carmichael等进一步改进并获得更好的效果，使之运用于人类肿瘤细胞体外药敏试验［8~9］。MTT法具有经济、快速、高效的优点。本实验美味猕猴桃根经过系统分离后，将其70%乙醇总提取物分为石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和95％乙醇4个部位，采用MTT法，选用宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、人肝癌细胞株Hele7404、小鼠肉瘤细胞株S180和小鼠肝癌细胞株H226种瘤株，对70%乙醇总提物和4个部位进行体外抗肿瘤的药理活性的实验研究，以期得到可信度较高的体外抗肿瘤的活性部位，同时为美味猕猴桃根的进一步研究提供依据。
       
       体外抗肿瘤实验结果表明，美味猕猴桃根的70％乙醇总提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、人肝癌细胞株Hele7404、小鼠肉瘤细胞株S180和小鼠肝癌细胞株H226种瘤株有明显的抑制作用。而石油醚提取物和95％乙醇提取物对小鼠肉瘤细胞株S180和小鼠肝癌细胞株H22两种瘤株表现出一定的抑制作用。
       
       体外实验表明，美味猕猴桃根醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物均有较好的抗肿瘤活性，并且呈剂量依赖关系。本研究结果为美味猕猴桃根的临床抗肿瘤应用及抗肿瘤活性成分的进一步分离筛选提供了依据。
       【参考文献】
         　　［1］ 钟振国，张凤芬，甄汉深，等.美味猕猴桃根提取物抗肿瘤作用的实验研究［J］.中医药学刊，2004，22（9）：1705.
       
       ［2］ 李 丽，梁 洁，甄汉深，等.美味猕猴桃根提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.广西中医药，2006，29（4）：50.
       
       ［3］ 李 丽，梁 洁，甄汉深，等.美味猕猴桃提取物对D-半乳糖胺诱导的肝损伤的影响［J］.广西医学，2006，28（10）：1608.
       
       ［4］ 李 丽，钟振国，梁 洁，等.美味猕猴桃根提取物对小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.时珍国医国药，2007，18（3）：封3.
       
       ［5］ 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学，第2版［M］.北京：人民卫生出版社，2002：1785.
       
       ［6］ 王天山，陆跃鸣，马国祥，等.鼓槌石斛中化学成分对K562肿瘤细胞株生长抑制作用体外实验［J］.天然产物研究与开发，1997，9（2）：1.
       
       ［7］ Mosmann T.Rapid colonimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and eytotoxicithy essay［J］.Immunol Meth,1983,65(1):55.
       
       ［8］ Denizot, Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival, Modification to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability［J］.Immunol Methods,1986,89(2):271.
       
       ［9］ Carmichael J, Draff WG, Gazdar AF, et al.Evaluation of tetrazolium based semiautomsted colorimetric assay:assessment of chemosensitivity testing［J］.Cancer Res,1987,47(4):936.