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       【摘要】 
       目的探讨六君子汤对环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）的增效减毒作用。方法建立S180荷瘤小鼠模型后，随机分为4组，即荷瘤对照组、CTX组、六君子汤高剂量+CTX组、六君子汤低剂量+CTX组，每组10只。造模次日开始给药，共10 d，停药次日处死，观察荷瘤小鼠肿瘤生长情况及对小鼠免疫系统和抗氧化酶的影响。结果六君子汤可提高CTX的抑瘤率及血清SOD、GSHpx活性，降低MDA含量，同时还能增强化疗荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力和自然杀伤细胞(NK)活性 (P<0.05)。结论六君子汤对化疗药物CTX具有增效减毒的作用，其作用可能是通过提高免疫系统功能和抗氧化功能实现的。
       【关键词】  六君子汤 环磷酰胺 增效减毒 肿瘤化疗
       Synergy and Attenuation of Cyclophosphamidum(CTX) Activities by LiuJunZi Decoction
       LIU Zhiqin ，ZHU Huixue，CHEN Queting ，JIANG Yufeng，SUN Hongli，HUANG Qifu
       (College of Pharmacology，Hebei University， Hebei，Baoding  071002，China； People"s Hospital of Hebei Tangxian，Hebei Tangxian  072350，China； Affiliated Hospital of Hebei University, Hebei  Baoding  071000，China； Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029，China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the synergy and attenuation of cyclophosphamidum(CTX) activities by LiuJunZi Decoction.MethodsS180 tumor bearing mice models were established and then divided randomly into four groups，including control group with tumor，CTX group， LiuJunZi Decoction (high and low dose) combined with CTX groups. Each group had 10 mice. After 10 days of treatment，the mice in the four groups were all killed. The effects of LiuJunZi Decoction on tumor weight，immune function and antioxidative enzyme were measured respectively. Results LiuJunZi Decoction could promote spleen lymthocyte proliferation，NK activity and increase tumor-weight-inhibiting rates，activity of SOD，GSH-pX，and decreased the concentration of MDA significantly compared with CTX group(P<0.05).ConclusionThe synergy and attenuation of LiuJunZi Decoction can be attributed to improve immune function and anti-oxidative capacity.
       Key words：LiuJunZi Decoction；   Cyclophosphamide；   Synergy and Attenuation；  Tumor  Chemotherapy
       
       肿瘤是目前严重危害人类生命健康的常见病。当前对肿瘤的治疗仍是以手术为主的综合治疗，其中术后化疗是预防转移和复发的重要治疗手段，然而化疗常引起如脏器损害和免疫力低下等毒副反应，使患者难以坚持治疗。近年来的研究显示，中医药在支持患者完成化疗疗程、增强疗效、防止毒副反应上有着重要的作用，临床运用广泛。六君子汤源自《妇人良方》，主治脾胃气虚兼有痰湿，症见恶心呕吐、胸脘痞闷、四肢无力等症状，其所治疗诸症恰恰为化疗中常见，但六君子汤在肿瘤化疗中的增效减毒作用报道较少，且缺乏系统性和规范性。本研究通过建立S180荷瘤小鼠模型，探讨六君子汤联合化疗药物环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）治疗肿瘤是否具有减毒增效作用，以期为该方的临床应用提供一定实验依据。
       1   材料与仪器
       1.1  动物和瘤株 清洁级昆明小鼠40只，8~10周龄，雌雄各半，体重18~22 g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证编号704113。动物在实验前适应性驯养1周。饲料和垫料由河北医科大学实验动物中心提供。实验期间自由采食饮水。腹水型S180瘤株由河北医科大学实验动物中心提供，L929细胞株由北京市中医研究所提供。
        
       1.2   药物六君子汤主要由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏等药物组成，由河北大学附属医院中药房提供，所有药品均经中药专家鉴定。取上述中药自来水浸泡1 h后，分别加8，6，4倍量的水煎煮3次，时间分别为药液熬开后40，30，20 min，将3次煎煮的药液混合，离心，取上清，80 ℃水浴浓缩至每毫升含生药0.8   g，高温消毒后置4℃冰箱保存备用。化疗药物为注射用环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号06112021)。
       1.3  试剂RpMI1640完全培养基(Amresco公司产品)，四氮甲唑蓝(MTT，Amresco公司产品)，DMSO(Amresco公司产品)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司产品)。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)测试盒(南京建成生物工程研究所)。
       1.4  仪器 酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司产品），CO2培养箱（上海福玛实验设备有限公司产品），超净工作台(苏净集团，苏州安泰空气技术有限公司产品)，倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司产品）。AE240电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司产品）。22pC分光光度计（上海棱光技术有限公司产品）。
       2  方法
       2.1  动物模型的建立［1］ 无菌条件下抽取传代第8天的S180小鼠的腹水，按1:3比例用生理盐水稀释，反复冲打、充分混匀，在显微镜下计数，用生理盐水调整细胞浓度为1×107/ml，取0.2 ml于每鼠右侧腋窝下碘酊消毒后皮下接种。瘤株接种前，均用0.2%台盼蓝染色，计算活细胞数为95%~98%。从抽取腹水时开始，到移植完最后一只小鼠的总时间控制在60 min内。
       2.2  分组及给药小鼠接种24 h后按体重和性别随机分成荷瘤对照组、CTX组、六君子汤（高、低剂量）+CTX组。荷瘤对照组用生理盐水灌胃，CTX组腹腔注射CTX 0.02 g·kg-1·d-1，同时用生理盐水灌胃，六君子汤高、低剂量+CTX组的化疗药物剂量、给药途径及时间与CTX组相同，六君子汤高、低剂量分别给予16，4 g·kg-1·d-1（按生药量计算，剂量由预实验得出）灌胃，各组灌胃容积均为0.2 m1/10g，1次/d，连续10 d。各组于瘤细胞接种后第2天开始用药，于实验第12天眼球采血后处死小鼠，取脾脏、肿瘤检测各项指标。
        
       2.3  抑瘤率计算于实验第12天，将各组小鼠眼球采血后处死，称重，依次用碘酊酒精消毒操作部位皮肤，于超净工作台上，以无菌操作从腋部皮下完整剥取肿瘤组织，剥离干净后于电子天平称瘤体重量并按公式计算抑瘤率［2］。
       
       抑瘤率（%）=（对照组瘤重-给药组瘤重/对照组瘤重）×100%
        
       2.4  NK细胞活性测定［3］无菌摘取脾脏，按常规制备脾细胞悬液，用含10%小牛血清的RpMI1640培养液配成1×107 /ml浓度作为效应细胞。取传代培养的L929细胞，用0.25%胰酶消化液消化2 min，加入完全RpMI1640培养液，调细胞浓度为2×105/ml作为靶细胞，在96孔平底板上每孔加入靶细胞悬液100 μl，37℃、5%CO2培养90 min，使其贴壁成单层细胞，然后实验孔加入100 μl效应细胞悬液，做4个复孔，靶细胞对照孔加完全RpMI1640培养液100 μl；然后将96孔板放在37 ℃，5%CO2孵箱中孵育20 h，去上清，用生理盐水轻轻注满各孔，反复3次，以除去效应细胞和被杀伤脱落的靶细胞，在滤纸上吸干孔内水分；每孔加入0.1%的中性红染液100 μl，孵育30 min，弃去染液，用生理盐水洗3遍，每孔加100 μl细胞裂解液（1:1的冰醋酸和无水乙醇），使含有中性红的靶细胞溶解，摇匀，用酶标仪在450 nm测OD值，用以下公式计算杀伤率。
       
       杀伤率(%)=(靶细胞OD值-实验组OD值)/靶细胞OD值×100%
       2.5  T淋巴细胞增殖能力的测定［4］  无菌摘取脾脏，常规制作脾细胞悬液，用含10%小牛血清的RpMI1640培养基重悬细胞，调细胞浓度至5×106／L，加入96孔细胞培养板100 μl/孔，再分别加入ConA 100 μl/孔使其终浓度为6 μg/ml，将上述加好的培养板置37℃、5%CO2培养箱68 h，取出，每孔吸出10μl，加0.5 g/L MTT 10 μL/孔，置培养箱内4 h，取出，加10%SDSHCL溶液100 μl/孔，振荡过夜，酶标仪测570 nm波长的吸光度(OD)值。以各样本A值代表其T淋巴细胞增殖能力。
       2.6   抗氧化酶测定荷瘤小鼠血清SOD，GSHPx和MDA含量的测定严格按说明书进行操作。
       2.7   统计学处理各组数据以±s表示，采用SpSS11.5 for Windows统计软件进行分析，多组间比较用OneWay ANOVA方差分析，P﹤0.05 有统计学意义。
       3  结果
       3.1  六君子汤对化疗荷瘤小鼠一般状况的影响 小鼠接种瘤细胞前，神情佳，被毛光泽，能自动觅食和饮水。瘤细胞接种后4 d，于小鼠右腋下接种部位可触及米粒大小的瘤结节，之后逐渐长大。CTX组及六君子汤各治疗组小鼠肿瘤生长的势头均不及荷瘤对照组。CTX组在腹腔注射CTX后，状况明显不及荷瘤对照组，小鼠出现毛无光泽而稀疏脱落，少动，懒于觅食，且这种状况日益加重，而六君子汤治疗组上述状况较轻。
       3.2  六君子汤对化疗荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响 由表1可以看出，CTX组、六君子汤高、低剂量组的瘤重与荷瘤对照组相比差异显著（P﹤0.01）；CTX组有明显的抑制肿瘤生长作用，抑瘤率达45.67%；六君子汤高、低剂量+CTX组抑瘤率分别可达54.49%和50.54%，CTX组与六君子汤高剂量+CTX组相比差异显著（P﹤0.05）。
       3.3   六君子汤对化疗荷瘤小鼠免疫系统的影响 荷瘤小鼠用CTX化疗后脾脏T淋巴细胞增殖活力及NK细胞杀伤活性均下降，而CTX联合六君子汤治疗后荷瘤小鼠淋巴细胞的增殖反应和NK细胞杀伤活性均有所提高，与CTX组比较差异显著(P<0.05)。
       3.4  六君子汤对化疗荷瘤小鼠血清抗氧化系统功能的影响荷瘤小鼠用CTX联合六君子汤治疗后血清SOD，GSHPx活力明显升高，MDA含量下降，与CTX组比较差异显著(P<0.05)。
       表1  六君子汤对化疗小鼠瘤重及抑瘤率的影响（略）
       与荷瘤对照组比较,**p﹤0.01；与CTX组比较,P﹤0.05 ；n=10
       表2  六君子汤对化疗荷瘤小鼠NK细胞杀伤率和淋巴细胞增殖的影响（略）
       与CTX组比较◇P﹤0.05 ，◇◇P﹤0.01；n=10
       表3  六君子汤对化疗荷瘤小鼠血清SOD，GSHPx，MDA的影响（略）
       与CTX组比较◇P﹤0.05；n=10
       4  讨论
          
       六君子汤源自《妇人良方》，功善健脾益气，燥湿化痰，和胃消痞，降逆止呕。方中人参为君，甘苦温相用，大补元气，益助脾胃；白术为臣，甘苦温相用，补气健脾，温中燥湿；茯苓为佐，甘淡平相用，渗湿健脾；陈皮健脾和中，行气止痛；半夏化痰湿、补脾气；甘草调中，补益脾胃之气。诸药合用标本兼顾，培正固本，从而可预防和改善诸种化疗副反应，提高患者化疗期间的生活质量。现代药理学研究证实［5］，六君子汤不仅具有抗肿瘤作用，还可调节免疫功能，保护脏器免受有害毒物损伤。本研究通过观察六君子汤联合CTX抗S180荷瘤小鼠的研究发现，六君子汤高剂量联合CTX组肿瘤抑制率高于CTX组，同时还发现六君子汤对CTX引起的荷瘤小鼠毛发无光泽、稀疏脱落，少动，懒于觅食等状况有改善作用，提示六君子汤对CTX抗移植瘤生长具有一定增效减毒作用。
       
       肿瘤患者的免疫功能与肿瘤的发生和发展密切相关 ［6，7］。肿瘤的存在抑制机体免疫功能［8］，而化疗药物应用可加重机体的免疫抑制。因此提高肿瘤患者的免疫功能，尤其是化疗后出现的严重免疫功能抑制，成为抗肿瘤治疗的一个主要方面。在抗肿瘤免疫方面，细胞免疫占主导地位，T细胞为细胞免疫的主要方面，是机体抗肿瘤免疫的核心力量，T淋巴细胞增殖反应率是一个能够代表机体免疫能力的重要免疫因素［9］。NK细胞是细胞免疫中的非特异性成分，主要发挥免疫监视功能和抗肿瘤作用，它不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，也可以通过产生IL2、干扰素等增强其他细胞的抗肿瘤作用，在机体免疫反应中起重要作用。因此NK细胞杀伤活性可有效地反映机体的免疫功能。本实验发现，荷瘤小鼠应用CTX后T淋巴细胞增殖和NK细胞杀伤活性均下降，而CTX联合六君子汤治疗后，二者均有所升高，提示六君子汤可对抗化疗药物CTX所致的免疫抑制，促进机体免疫功能的恢复，从而可提高机体的抗肿瘤作用。
       
       自由基的研究属于新兴的亚分子生物学范畴，机体内自由基的含量与肿瘤的关系非常密切。SOD和GSHPx是体内重要的抗氧化酶，SOD的主要作用是清除体内氧自由基，防止活性氧对细胞产生损伤作用。GSH的作用是防止脂质过氧化物形成。MDA是细胞膜脂质过氧化物的终产物，测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反应出细胞损伤的程度。癌症的发生发展与氧化损伤密切相关。有资料显示，肿瘤组织中过氧化脂质增加，而抗氧化物酶的活性下降。本实验发现六君子汤可提高化疗荷瘤小鼠血清SOD活性与GSHPx水平，降低MDA的含量，提示六君子汤可提高化疗小鼠的抗氧化酶活性和减少脂质过氧化产物的生成，从而可清除体内自由基，减轻氧化损伤的程度。
       
       综上所述，六君子汤与化疗药物CTX合用具有增效减毒作用，其作用可能是通过提高机体免疫力和抗氧化系统功能两途径实现的。这为六君子汤在肿瘤化疗中的应用提供了一定实验依据。
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