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       【摘要】 
       目的建立泸州山银花中绿原酸和总绿原酸的含量测定方法。 方法采用高效液相色谱（HPLC）法测定绿原酸，并采用UV法测定总绿原酸。色谱柱为Dikma Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.4％磷酸溶液（12∶88）；流速0.8 ml·min-1；检测波长326 nm；柱温30℃；进样量10 μl。 结果绿原酸在0.16～1.6 μg范围内具有良好的线性关系（r＝0.999 9），平均回收率为98.75％，RSD为0.29％。 结论该方法操作简便、快速、有效、灵敏、准确、具有良好的重复性和回收率，可作为山银花中绿原酸和总绿原酸的含量测定方法。
       【关键词】  高效液相色谱 山银花 总绿原酸 高效液相色谱
       Determination of Chlorogenic Acid and Total Chlorogenic Acid in LuZhou Flos Lonicerae
       PENG Feng， WANG Yong，WANG Hechuan，CHEN Jun，FENG Wenyu，HE Bing
       (Luzhou Center for Disease Control and Prevention, Luzhou 646000, China； Institute of Materia Medica of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China)
       Abstract：ObjectiveTo establish the method for content determination of Chlorogenic Acid and total Chlorogenic Acid in Flos Lonicerae. MethodsThe content of chlorogenic acid was detected by HPLC，and total chlorogenic acid was detected by UV. The separation was carried out on a Dikma Kromasil C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm）．The mobile phase was acetonitrile-0.4% phosphoric acid，the flow rate was 0.8 ml·min-1，the detection wavelength was set at 326 nm，the column temperature was 30℃ and the sample size was 10 μl．ResultsThe calibration curve showed good linearity over the range of 0.16～1.6 μg（r＝0.999 9）. The average recovery was 98.75％ with RSD was 0.29％.ConclusionThis method is simple，rapid，efficient，sensitive，accurate and with good repeatability and recovery，it can be used as a quantitative analysis method for this preparation．
       Key words:Flos Lonicerae；  Chlorogenic acid；  Total chlorogenic acid；  HPLC
       
       山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.，红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.或华南忍冬Lonicera confuse DC.的干燥花蕾或带初开的花，具有抗菌消炎、清热解毒、凉散风热的功效，主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病等疾病［1］。其主要有效成分为有机酸类（绿原酸和异绿原酸）。绿原酸含量高低是山银花内在质量的标志，与药用价值和临床疗效密切相关。山银花分布广泛，而产地不同，绿原酸的含量存在着较大的差异［2~3］。四川泸州山银花作为川银花的一个重要来源，其绿原酸含量测定尚未见报道。为全面了解本地区山银花绿原酸的变化及差异，我们采用HPLC首次对泸州四县不同产区采摘的山银花中所含的绿原酸和总绿原酸进行了含量测定，为开发利用本地区的山银花提供科学依据。
       1  仪器与试药
       1.1   仪器戴安高效液相色谱仪（P680A四元低压梯度泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站）；瑞士Precisa电子天平（XR 205SM-DR）；CQX25-06超声波清洗器（上海必能信超声有限公司，功率250 W，频率25 kHz）。
       1.2  对照品绿原酸（110753-200412），中国药品生物制品检定所提供。在选定色谱条件分离后按面积归一化法计算含量为98.38%，符合含量限度要求，故以含量为100%计算。
       1.3  试药甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
       1.4  样品山银花，10批，分别收购于泸州纳溪、叙永、合江和古蔺，经作者鉴定均为灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.。
       2  方法与结果
       2.1  绿原酸的含量测定
       2.1.1  色谱条件  色谱柱为Dikma Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4％磷酸溶液（12∶88），流速0.8 ml/min，柱温30℃，检测波长326 nm。
       2.1.2  对照品溶液的制备 取经五氧化二磷减压干燥至恒重的绿原酸对照品4.0 mg，精密称定，置50 ml棕色量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升含绿原酸80 μg）。
       2.1.3  供试品溶液的制备  取山银花适量，50℃烘约5 h，粉碎为细粉（过4号筛）。取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50 ml，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密取续滤液5 ml，置25 ml棕色量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
       2.1.4  系统适应性实验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1。从图1中可见，绿原酸的保留时间约为10 min，绿原酸峰与其前后色谱峰的分离度分别为12.60，3.34，均大于1.5，拖尾因子为1.03，理论塔板数以绿原酸峰计为15 417，绿原酸峰纯度因子为1 000。
       图1  山银花HPLC色谱图（略）
       2.1.5  线性关系考察  分别精密吸取绿原酸对照品溶液（80 μg·ml-1）2，4，6，8，10，15，20 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积A对进样量C（μg）进行回归，得标准曲线方程：A＝34.815 2C + 0.268 5，r＝0.999 9。结果表明，绿原酸在0.16～1.6 μg范围内，峰面积与进样量有良好的线性关系。
       2.1.6  精密度实验  精密吸取同一供试品溶液10 μl，按上述色谱条件连续进样5次，测得绿原酸峰面积RSD为0.46％。表明仪器精密度良好。
       2.1.7  重复性实验  取同一批山银花（批号050701），按供试品溶液制备方法制得5份供试品溶液，分别精密进样测定，测得绿原酸的平均含量为3.269 2％，RSD为0.82％。表明本方法重复性良好。
       2.1.8  稳定性实验  取本品供试品溶液，分别于制备后0，2，4，6，8，10，12，24，36 h精密进样10 μl，测得绿原酸的峰面积RSD为1.54％，表明供试品溶液在36 h内稳定。
       2.1.9  加样回收实验  精密称取已知含量（3.269 2％）的山银花（批号050701）细粉9份，每份约0.5 g，分成3组，每组2份，分别精密添加绿原酸对照品溶液（4.108 mg·ml-1）3，4，5 ml，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，并计算回收率。结果见表1。实验结果表明，本法具有良好的回收率。
       表1  加样回收率实验测定结果（略）
       2.1.10  样品测定  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，纪录色谱图，以外标法计算样品中绿原酸的含量。结果见表2。
       2.2  总绿原酸的含量测定取山银花粉末0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇50 ml，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液0.5 ml，置50 ml棕色量瓶中，加0.2 mol·ml-1盐酸液稀释至刻度，摇匀，用0.2 mol·ml-1盐酸液作空白，照分光光度法，在324 nm波长处测定吸收度，按绿原酸（C16H18O9）的吸收系数（ E1%1 cm）为526计算［4］，即得。泸州山银花中总绿原酸的测定结果见表2。
       表2  泸州山银花中绿原酸含量测定结果（略）
       3  讨论
          
       实验中针对含量测定配制供试品溶液的不同提取方法（超声、回流及溶剂萃取），不同提取溶剂（甲醇，75％甲醇，50％甲醇，25％甲醇，水和流动相），不同溶剂体积（10，25，50，75，100 ml）及不同提取时间（15，30，45，60 min）分别考察。结果以50 ml 50％甲醇超声提取45 min含量最高，杂质峰较少。
       
       采用二极管阵列检测器在190～380 nm范围内分别扫描绿原酸对照品、供试品溶液中绿原酸峰的紫外吸收，对照品和供试品中的绿原酸的最大吸收峰分别为326.1，325.8 nm，故选用326 nm作为测定波长。
       
       实验结果表明泸州不同产区所产山银花，由于绿原酸生长环境、气候条件、采收时间、加工方法等因素的不同，造成其绿原酸和总绿原酸含量相差较大。但泸州地区山银花中绿原酸含量总体较其他地区偏高，特别是古蔺山区所产山银花，绿原酸最高含量达6.28％，总绿原酸最高含量达13.86％。而文献［2］报道的湖南怀化、贵州、河北、广西、山东、河南所产山银花中绿原酸的含量分别为：3.25％，2.02％，1.98％，3.34％，2.41％，2.52％。文献［3］报道湖南隆回、广东连县、广西桂林、贵州同仁、四川中江、重庆秀山、江西萍乡所产山银花中绿原酸的含量分别为：5.16％，2.86％，3.73％，4.32％，3.78％，3.96％，2.84％。可见古蔺银花作为川银花的代表，一直以来备受生产厂家的青睐，有其一定科学依据。
       
       研究表明绿原酸和异绿原酸均有抑菌、抗病毒、解热、抗炎等作用［5］，且近来研究发现二咖啡酰奎尼酸（异绿原酸为3,5-二咖啡酰奎尼酸、4,5-二咖啡酰奎尼酸、3,4-二咖啡酰奎尼酸、1,3-二咖啡酰奎尼酸等的混合物）尚在治疗乙肝及艾滋病上有显著疗效［6］，故山银花药材，仅以绿原酸含量权衡其质量并不科学，应加上异绿原酸含量或总绿原酸的含量作为评价山银花药材质量的依据（由于异绿原酸为混合物，且无相应对照品，故目前尚无法采用HPLC测定异绿原酸的含量，仅能以UV测定绿原酸和异绿原酸的总和即总绿原酸的含量）。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会，中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：21.
       
       ［2］ 舒胜辉. 不同产地山银花有效成分绿原酸含量的比较研究［J］.中医药导报，2006，12(2)：74.
       
       ［3］ 曹冬红，张贺文，杨 科，等.高效液相色谱法测定山银花中绿原酸的含量［J］.中南药学，2007，5(1):36.
       
       ［4］ 四川省卫生厅．四川省药品标准·中药成方制剂［M］.成都：四川科学技术出版社，1993:170.
       
       ［5］ 刘恩荔，李青山. 金银花的研究进展［J］.山西医科大学学报，2006，37(3):331.
       
       ［6］ 董俊兴．抗乙肝和艾滋病新药二咖啡酰奎尼酸进入临床［J］.科技中国，2006，124(4):63.