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       【摘要】 
       目的以绿原酸和咖啡酸为定量指标，建立蒲公英提取物的质量标准。方法采用薄层色谱法（TLC）为蒲公英提取物制定定性鉴别方法；采用高效液相色谱（HPLC）法测定其中的绿原酸和咖啡酸含量。结果绿原酸在0.003 125~0.05 mg/ml与峰面积具有良好的线性关系，R2=0.999 5。咖啡酸在0.003 125~0.05 mg/ml与峰面积具有良好的线性关系，R2=0.999 9。绿原酸和咖啡酸平均回收率分别为98.89％和99.65％，RSD分别为1.05％和1.34％。结论建立的方法简便、准确、可靠，可作为控制该药品的质量标准。
       【关键词】  蒲公英提取物 绿原酸 咖啡酸 质量标准 高效液相色谱
       Studies on Quality Standard of Dandelion Extracts
       PAN Jian, LIANG Juan, XIE Huiming, ZHANG Wencheng
       （Hefei University of Technology, Hefei 230009, China）
       Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard of Dandelion extracts with chlorogenic acid and caffieic acid as quantitative markers. MethodsWith the technology of orthogonal test, Dandelion extracts were identified by TLC. The chlorogenic acid and caffeic acid content were detected by high performance liquid chromatogram（HPLC）.ResultsThe chlorogenic acid had good linear relationship within the rauge of 0.003 125~0.050 000 mg/ml. R2=0.999 5. And the caffeic acid had good linear relationship with 0.003 125~0.05 mg/ml. R2=0.999 9. The recoveries of chlorogenic acid and caffieic acid were 98.89% and 99.65%, RSD were 1.05% and 1.34%, respectively. ConclusionThe method is simple, accurate, credible, which can be used as the quality control standard of Dandelion extracts.
       Key words：Dandelion extracts；  Chlorogenic acid；  Caffeic acid；  Quality standards；  HPLC
       
       中药提取物是一类新兴的天然药物产品，被广泛用于医疗保健。在我国以中药材为原料的中药提取物已形成了一定的生产规模。中药提取物的质量规范对中药产业的发展至关重要，但是目前绝大多数的中药提取物没有国家标准或行业标准［1］ 。蒲公英提取物作为市场畅销的中药提取物之一，制定其质量标准对其在中药产业的发展有非常重要的意义。
       
       蒲公英提取物富集了蒲公英药材中的有效成分，含有多种活性物质，如倍半萜烯内酯、三萜类、植物甾醇、酚酸类化合物、黄酮类物质、类固醇等，而其中酚酸类化合物含量丰富。尤其是咖啡酸和绿原酸含量较高，是蒲公英提取物的主要有效成分［2，3］ 。绿原酸具有抗氧化作用，特别是绿原酸的生物活性，能促进人体的新陈代谢、调节人体各部功能的平衡等功效。因此绿原酸成分的研究和利用越来越受到人们的重视［4］ 。咖啡酸具有广谱抗菌、消炎利胆、利尿通淋等作用。《中国药典》2005年版(Ⅰ部)仅制定了蒲公英药材中咖啡酸检测方法［5，6］ 。本实验同时以蒲公英提取物中的绿原酸和咖啡酸为指标建立蒲公英提取物质量标准，用高效液相色谱法同时检测蒲公英提取物中咖啡酸和绿原酸含量。
       1   仪器与试药
       1.1   仪器Waters高效液相色谱仪（Waters515高压泵，microliterTM#702型手动进样针，Waters2487紫外检测器，Empower数据处理系统），SIGMA 3K15型离心机，Mettler Toledo AG135型电子天平。
       1.2   试药蒲公英药材由亳州济人药业有限公司提供，咖啡酸和绿原酸对照品购于中国药品生物制品检定所。硅胶G（青岛海洋化工厂），甲醇为色谱级，磷酸和磷酸二氢钠为分析纯，水为超纯水。其他试剂均为分析纯。
       2   方法与结果
       　　
       2.1   定性鉴别
       2.1.1   供试品溶液的制备取蒲公英提取物1 g，加甲醇20 ml，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 ml使溶解，滤过，滤液用醋酸乙酯振摇提取2次，10 ml/次，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。
       2.1.2   对照品溶液的制备取咖啡酸对照品，加甲醇制成每毫升含0.5mg的溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。
       2.1.3   薄层层析吸取上述3种溶液各6 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸丁酯－甲酸－水（7∶2.5∶2.5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检测。供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
       2.2   含量测定
       2.2.1   色谱条件  色谱柱为Agilent Hypersil ODS柱，（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为甲醇－磷酸盐缓冲液（pH 4.0）：（23∶77），检测波长323 nm，柱温25℃，流速为1.0 ml/min。灵敏度：1.0AUFS；理论塔板数按咖啡酸峰计算应不低于3 000，咖啡酸峰与其他峰能达到基线分离，且出峰时间适宜，峰形较好。
       
       2.2.2   对照品溶液的制备  分别精密称取在110℃干燥至恒重的绿原酸和咖啡酸对照品各2.5 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得0.025 mg/ml的对照品溶液。
       
       2.2.3   供试品溶液的制备  取蒲公英提取物干粉0.5 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加含5％甲酸的甲醇溶液50 ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用含5％甲酸的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，滤液置棕色量瓶中，即得。
       2.2.4   线性关系考察  分别精密称取在110℃干燥至恒重的绿原酸和咖啡酸对照品各2.5 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再用甲醇逐级稀释得0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 125 mg/ml 5个不同浓度的对照品溶液，分别进样10 μl，测定其峰面积，然后分别以绿原酸和咖啡酸的浓度为横坐标，5次测定峰面积的均值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为绿原酸：Y＝3×107X-24 923,R2=0.999 5；咖啡酸：Y＝5×107X+8 862.3, R2=0.999 9。实验结果表明绿原酸和咖啡酸的浓度在0.003 125～0.05 mg/ml范围内均与所测得的相应峰面积呈良好的线性关系。
       2.2.5   精密度实验 精密吸取对照品溶液10 μl进样，重复进样6次。按上述色谱条件测定绿原酸的峰面积分别为735 557，723 229，730 246，735 043，720 147，724 230，RSD＝0.89％。咖啡酸的峰面积分别为1 255 324，1 275 697，1 267 064，1 270 335，1 292 704，1 243 824，RSD＝1.33%。结果表明本方法的精密度良好。
       2.2.6   稳定性实验 精密吸取供试品溶液，按上述色谱条件，每隔1h进样1次，共进样6次。绿原酸峰面积分别为505 928，506 310，510 911，515 970，518 800，510 034，RSD＝1.01％。咖啡酸的峰面积为798 944，797 559，803 781，811 651，820 222，816 674，RSD＝1.17％。结果表明，绿原酸和咖啡酸的峰面积在5 h内无明显变化，供试品溶液稳定性好。对照品及供试品色谱图见图1~2。
       2.2.7   重复性实验取同一批样品，平行实验6次，测得绿原酸含量为1.775，1.734，1.808，1.750，1.788，1.75，RSD＝1.52％。咖啡酸含量为1.606，1.583，1.628，1.567，1.613，1.60 1，RSD＝1.36％。结果表明，在同一条件下，6次测得样品绿原酸含量及咖啡酸含量一致，本方法重复性好。
       图1  对照品色谱图（略）         
       图2  供试品色谱图（略）
       2.2.8   回收率实验  采用加样回收法，精密称取已知含量的样品6份，每份0.5 g，分别精密添加绿原酸对照品1.8 mg和咖啡酸对照品1.6 mg，按“2.2.3”的方法制成供试品溶液，各取10 μl进样，测定绿原酸和咖啡酸的含量。计算平均回收率分别为98.89％和99.65％，RSD分别为1.05％和1.34％。实验结果表明，本方法回收率好。
       2.2.9   样品含量测定 按“2.2.3”项的方法制备样品，用上述方法对以下不同批次样品进行含量测定。结果见表1。
       表1  蒲公英提取物中绿原酸和咖啡酸含量测定结果（略）
       3  讨论
          
       有人以单独的咖啡酸或绿原酸为指标，对蒲公英药材或制剂进行质量评价［4，7］。蒲公英提取物与蒲公英药材的化学成分及含量有所不同。为了更好地评价蒲公英提取物，本实验在前人研究的基础上同时以绿原酸和咖啡酸为指标，对蒲公英提取物进行质量标定。
       
       本法参考了《中国药典》2005年版Ⅰ部蒲公英中咖啡酸的测定方法，并新加入了绿原酸作为检测指标，考虑同时以咖啡酸和绿原酸作为检测指标，本实验在原有的检测条件下做了若干改进，获得较好的效果，能有效控制蒲公英提取物质量。
       【参考文献】
         　　［1］ 徐为公,徐 鹏.中药提取物的国际化策略［J］.中药研究与信息,2005,7（10）:34.
       
       ［2］ Katrin Schütz, Reinhold Carle, Andreas Schieber. Taraxacum－A review on its phytochemical and pharmocological profile［J］. Journal of Ethnopharmacology, 2006,107:313.
       
       ［3］ W. Kisiel, B. Barszcz. Futher sesquiterpenoids and phenolics from Taraxacum officinale ［J］. Fitoterapia, 2000(71): 269.
       
       ［4］ 周小平,赵厚民.RP-HPLC法测定蒲公英中绿原酸含量［J］.江苏药学与临床研究,2006,14（3）:211.
       
       ［5］ 晏 媛,许重远,陈志良,等.高效毛细管电泳法测定蒲公英中咖啡酸的含量［J］.中药材,2004,24(2):100.
       
       ［6］ 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005:244.
       
       ［7］ 盛晓静,刘 薇.复方公英片质量标准研究［J］.中成药,2006,28（12）:1853.