文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的保证乌头ISSR-PCR的稳定性、提高对乌头遗传多样性,亲缘关系分析、种质鉴定的可靠性。方法收集西南地区23个乌头材料，以Mg2+，dNTP，引物和聚合酶建立L9（34）正交设计，并同时考察模板和甲酰胺浓度及退火温度，建立适宜的ISSR-PCR体系。结果以Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.3 μmol/L、rTaq酶1U、模板1.5 ng/μl、甲酰胺2%及退火温度（Tm-3）℃的ISSR反应体系最优。结论实验建立的ISSR-PCR体系反应稳定，能用于乌头的ISSR分析。
       【关键词】  乌头 简单序列重复区间 优化
       Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Aconitum carmichael Dexb.
       ZHANG Yuefeng, WAN Lixiang, HOU Dabin*
       (Medicinal Plant Research Lab of Life Science and Engineering Department, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010,China)
       Abstract：ObjectiveTo keep the stability of ISSR_PCR and reliability of genetic diversity, sibship analysis and source assessing for Aconitum carmichael Dexb. Methods23 kinds Aconitum carmichael Dexb. samples in southwest of China were selected to carry out 4 factors(Mg2+，dNTP，primer and Taq polymerase) and 3 levels(concentration) orthogonal design experiment. Meanwhile separated experiments for forma-mide, template concentration and annealing temperature affect were carried out.ResultsISSR_PCR reaction system could be well established through orthogonal design experiment by 23 samples ISSR-PCR reaction assessing.ConclusionThe optimized ISSR-PCR reaction system can be stably used for Aconitum carmichael Dexb. genetic analysis.
       Key words：Aconitum carmichael Dexb.;   Inter-Simple Sequence Repeat;   Optimization
       
       乌头Aconitum carmichael Dexb．为毛茛科乌头属植物，别名五毒根［1］。为毛茛科植物乌头，在中国西南地区四川盆地有较大栽培面积，其母根叫乌头或川乌，为镇痉剂，可用于治风痹、风湿神经痛。侧根（子根）入药，称附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)。
         
       ISSR-PCR技术，简单序列重复区间(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)，是Zietkiewicz等［2］1994年创建的，引物是根据基因组内某一重复序列设计出一系列特异性引物，包括双核苷酸、三核苷酸和四核苷酸等微卫星片段。这种技术除具有RAPD优点外，比RAPD技术更具有明确的针对性，同时由于PCR扩增条件中的退火温度较高(50℃左右)，保证了PCR扩增的可重复性，结合了SSR和RAPD的优点。可以快速、高效和灵敏地检测出基因组DNA的多态性, 有很好的重复性, 操作简单、成本较低, 适合大样本的检测［3］。关于野生乌头的RAPD的优化与遗传分析已有报道［4］，川乌ISSR遗传分析也有报道［5］。因此建立稳定好、重复性强的ISSR反应体系对乌头遗传学、种质资源、分类学与种系发生学等方面具有重要意义。
       1  材料
          
       从四川绵阳安县晓坝（海拔850 m）已建立的附子资源圃200份附子种质资源类型中筛选出优势代表材料23份（见表1），上年种植，200707采摘顶部功能嫩叶数片，置4℃保存，提取DNA所用。
       表1  乌头样品引种来源（略）
       2  方法
       2.1  DNA提取采用陈亮［6］并稍加改良的CTAB方法提取DNA，通过紫外和琼脂糖电泳检测其纯度、浓度和完整性后，用以ISSR-PCR优化实验。
       2.2  反应体系正交实验 采用L9(34)正交实验设计，对Mg2+（大连TaKaRa提供），dNTP（TaKaRa），引物（上海生工提供）和rTaq聚合酶（TaKaRa）进行4因素3水平［7］筛选，方案如表2。根据表2制备总体积为20 μl的反应体系，体系中还存在1×PCR缓冲液和30 ng模板DNA，其余用过柱超纯水补充，引物选用哥伦比亚UBC系列847号引物，在德国Eppendorf Mastercycler Gradient仪上扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，Tm847－3℃(52.8-3=49.8℃)退火45 s，72℃延伸2 min，40个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。
       
       扩增结束后，PCR产物在1.5%的含溴化乙锭(0.5 μg/ml)琼脂糖凝胶电泳，电极缓冲液为0.5×TBE,电压3V/cm,电泳结束在Bio-Rad凝胶成像系统分析并拍照。
       2.3   模板DNA浓度筛选   应用表2中最佳组合，选用引物UBC846，20 μl体系中模板浓度分别置为0.5，1.5，3.0 ng/μl和6 ng/μl共4个浓度处理。
       2.4  甲酰胺对扩增稳定性实验选定的正交最佳反应体系,选用引物UBC846，20 μl体系中设空白对照；甲酰胺(绵阳荣盛AR)浓度分别为0.5%，1.0%，2.0%和4.0%。
       表2  ISSR-PCR正交实验设计（略）
       2.5  不同复性温度影响   根据正交最佳体系，结合引物UBC846用梯度PCR仪设定PCR退火温度梯度范围45～55℃。
       3  结果
       3.1  PCR正交实验分析PCR扩增结果是由Mg2+，dNTP引物和DNA聚合酶综合交互共同决定的，从图1中可以看出，各种因素的浓度差异，扩增结果有显著的差别。其中8，7，9号谱带依次增强，其原因是由于rTaq酶的增加。2，4，8酶量相同，PCR产物随Mg2+和dNTP的浓度的增加而增加，当浓度过高时候就会产生条带亮度增大，出现模糊的边缘，甚至产生背景使条带的混连。3号谱带较弱可能是因为Mg2+浓度过低而dNTP浓度偏高，由于dNTP能够和Mg2+结合使得游离Mg2+进一步减少，影响了rTaq的活性。5，7，9号谱带弥散是因为Mg2+浓度过高而引起。在dNTP浓度相同时，过量的酶或Mg2+会造成严重的背景干扰和非特性产物的扩增。第6泳道非常清晰，背景很小。通过比较以特异谱带多态性高、背景干扰低、主带清晰、副带明显为原则，同时考虑实验成本，即采用Mg2+2.0 mmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，引物0.3 μmol/L，rTaq聚合酶1 U的最佳20 μl反应体系。
       图1  正交设计ISSR_PCR反应结果（略）
       3.2   模板浓度的确定   由图2可以见，当20 μl反应体系中，模板量从0.5～6 ng/μl均有扩增，但到了浓度达到6 ng/μl条带变得异常模糊，1.5 ng/μl浓度的模板扩增效果很清楚，因此反应体系中模板浓度确定为1.5 ng/μl。
       图2  不同模板浓度对扩增影响（略）
       3.3  甲酰胺浓度的确定在筛选引物的时候，发现有些引物尤其是Tm较低的非锚定引物，扩增时有非特异拖带，其原因是引物在模板上滑动的结果。因此在体系中加入甲酰胺，结果如图3，表明0.5%浓度过低，几乎无效果，其它浓度均有一定的效果，其中以2%降低背景效果最明显。
       图3  不同甲酰胺浓度对扩增影响（略）
       3.4  退火温度的确定梯度退火结果(图4)显示,退火温度较低时 (45.0～47.8℃),谱带背景较高，随着退火温度升高(49.3～55.0℃),引物与模板的特异性结合增强,扩增条带逐渐减少,从8条降到2条，当退火温度为51.0℃时扩增背景较低,主带清晰,副带明显,多态性好，比引物UBC-846Tm值(53.8℃)略低，退火温度为52.4℃时,谱带强度较弱,因此本试验的退火温度为(Tm-3)℃。
       图4  温度对ISSR扩增的影响（略）
       3.5  扩增体系的运用根据以上的结果得知乌头ISSR-PCR最佳的反应条件为Mg2+2.0 mmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，模板1.5 ng/μl，引物0.3 μmol/L，rTaq聚合酶1U，2%甲酰胺的20    μl反应体系，退火温度为(Tm-3)℃。以上述条件用引物UBC855对23份乌头材料进行扩增，结果如图5所示。该引物在23份材料上都能扩增出清晰、重复性好、多态性高的谱带,表明已确立的ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于乌头遗传多样性分析、种质资源鉴定等研究。
       图5  优化的ISSR-PCR反应体系对23份乌头种质DNA扩增结果（略）
       4  讨论
          
       影响ISSR_PCR结果的因素很多［8］，为了获得重复性和可靠性较高的谱带,提高准确性，需要根据各自的设备对各种试剂、酶、引物和模板以及反应条件进行筛选调整和优化，同时需要考虑PCR反应中各试剂Mg2+、dNTP、引物和rTaq聚合酶的交互作用，例如：引物和模板竞争rTaq酶,rTaq聚合酶是Mg2+依赖性酶,受Mg2+浓度影响,而Mg2+又受的dNTP拮抗作用。因此采用正交设计该实验体现了多因素的互相作用结果。实验表明：只要反应条件保持稳定，试剂来源和浓度保持一致并对设备条件严格控制，重复性好的ISSR_PCR是容易实现的。
       
       由于乌头DNA提取时候易受多糖和多酚污染，因此在保证扩增效果好的情况下，使模板浓度控制在有效范围内的较低值较好［9］。
       
       退火温度是影响PCR扩增的重要因素，UBC系列ISSR引物多为18bp的重复序列，分为锚定引物和非锚定引物，对于锚定引物我们采用（Tm-3）℃退火效果很好，对于非锚定引物，这些引物在结合在模板上时容易滑动，扩增时容易产生类似酶切现象的拖带，可能是引物在与模板结合过程中产生了滑动现象［10］，因此对这些引物提高退火温度略高于Tm［11］，或者通过在体系中加入DMSO，甲酰胺［12］，甘油等［13］Taq聚合酶抑制剂［14］，可以有效降低这种背景模糊。本实验通过甲酰胺不同浓度梯度检测,结果以2%的甲酰胺降低背景效果最为明显。
       
       本实验建立的反应体系和优化的扩增条件：Mg2+2.0 mmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，引物0.3 μmol/L，模板1.5 ng/μl，rTaq聚合酶1 U，2%甲酰胺的20 μl反应体系，退火温度为(Tm-3)℃，反应稳定、重复性好，是适用于乌头ISSR-PCR扩增分析的。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：28.
       
       ［2］ Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D,el a1. Genomic Fingerprinting by simple sequence repeat (SSR )-anchored polymerase chain reaction amplification［J］.Genomic, 1994,20:176.
       
       ［3］ Meloni M, Perini D, Filigheddu R, et al. Genet ic variation in five Mediterranean populations of Juniperus phoenicea as revealed by inter- simple sequence repeat (ISSR) markers［J］.Annals of Botany, 2006, 97(2): 299.
       
       ［4］ 侯大斌. 乌头基因组DNA提取和RAPD反应体系的优化［J］.西南科技大学学报，2005，20（2）:70.
       
       ［5］ 罗 群，马丹炜，王跃华.川乌遗传多样性的ISSR 鉴定［J］.中草药，2006，37（10）:1555.
       
       ［6］ 陈 亮，陈大明，高其康，等.茶树基因组DNA的提取与鉴定［J］.茶叶科学，1997,17(4)：177.
       
       ［7］ 李春喜.生物统计学［M］.北京：科学出版社，1993：330.
       
       ［8］ Jonsson B O, Jonsdot tir IS,Cronberg B.Clonal diversity and allonzyme variation in population of the arctic Carex bigelowii［J］.Ecol,1996,84:449.
       
       ［9］ 邹喻苹,葛 颂,王小东.系统与进化植物学中的分子标记［M］.北京：科学出版社,2001：36.
       
       ［10］ Sobral W S,Honeycutt R.I. High output genetic mapping of polyploids using PCR-generated markers［J］.Theoritical and Applied Genetics 1993,86(1):105.
       
       ［11］ 宣 朴，邓 婧，陈 新，等.苦瓜ISSR扩增条件优化的研究［J］.核农学报，2006,20(3):215.
       
       ［12］ 何 桥,梁国鲁,谢江辉.莲雾反应体系的优化与应用［J］.果树学报，2005,22(2):186.
       
       ［13］ 王彦华,侯喜林,徐明宇.正交设计优化不结球白菜ISSR反应体系研究［J］.西北植物学报,2004,24(5): 899.
       
       ［14］ 张君毅, 郭巧生，杭悦宇.半夏-反应体系的建立及条件优化研究［J］.江苏农业科学,2007，(2):154.