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       【摘要】 
       目的研究纯化麦冬总皂苷的工艺条件。方法利用AB-8大孔吸附树脂吸附麦冬总皂苷，用乙醇梯度洗脱，确定麦冬总皂苷的吸附容量，考察洗脱条件，确定洗脱参数。结果AB-8大孔吸附树脂吸附容量为53.16 mg/ml，乙醇浓度在80%洗脱麦冬总皂苷效果最佳，回收率为85.49%。结论该方法简单，方便，纯化效果良好，结果满意。
       【关键词】  麦冬 大孔吸附树脂 总皂苷
       Study on the Purification of Ophiopogon japonicus Total Saponins with Absorption Resin
       CHE Renguo， SHEN Hongwei， SHANG Xiumei， FU Shaoping ， JIN Fengxie， YU Hongshan*
       (College of Bio. & Food Technology , Dalian Institute of Light Industry, Dalian 116034, China)
       Abstract：ObjectiveTo purify the total saponins in root of Ophiopogon japonicus.MethodsWe made use of AB-8 resin column to absorb saponins and alcohol to elute in different concentrations, confirmed the static absorption capacity of total saponins and studied elution requirement and parameter ascertainment of AB-8 resin.ResultsThe total saponin absorption amount  of AB-8 resin column reached 53.16 mg/ml. When the alcohol was used for washing buffer, the best concentration of alcohol for eluting saponins was 80% and the recovery rate was 85.49%.ConclusionThis method is sensitive and accurate.
       Key words：Ophiopogon japonicus；  Resin column；  Saponins
       
       麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.f.) Ker-Gawl. 的干燥块根，是一味常用滋阴中药，始载于《神农本草经》，历代重要本草都有记载。其味甘、微苦，性微寒，归心、肺、胃经，有养阴生津、润肺清心的功效，可用于热病伤津、心烦口渴等病症。现代研究发现，麦冬含有甾体皂苷、高异黄酮、多糖［1，2］、氨基酸等成分［3］，其中麦冬皂苷类成分具有耐缺氧、抗肿瘤、降血糖等作用［4］，在中医临床上用于治疗冠心病、心绞痛，并取得了一定疗效。目前，国内外利用大孔吸附树脂对麦冬皂苷纯化的研究比较少，主要是研究麦冬皂苷乙醇提取工艺［5，6］，利用硅胶树脂纯化麦冬皂苷以及HPLC-ELSD法测定川麦冬中有效成分含量［7］。本实验考查了AB-8大孔吸附树脂对麦冬总皂苷的吸附能力，并对麦冬总皂苷进行纯化，用不同梯度的乙醇对麦冬总皂苷进行洗脱，测定不同梯度洗脱液中麦冬总皂苷的含量，利用HPLC检测不同梯度洗脱的皂苷成分，以期为麦冬总皂苷的分离纯化提供有利的依据。
       1  器材
          
       麦冬,市售，浙江慈溪产；对照品（短葶山麦冬皂苷C）、80%短葶山麦冬皂苷由中国药科大学余伯阳教授提供；AB-8大孔吸附树脂(天津农药股份有限公司树脂分公司)；SGK一2LB(5LB)低噪音空气泵(日本三菱化成公司生产)；RE52AA旋转蒸发器(日本三菱化成公司生产)；薄层层析板Silica gel 60 F254为Merck公司产品；其它试剂均为分析纯或生化纯。
       2  方法
       2.1  麦冬总皂苷的制备取0.2 kg麦冬粉末以6 L的70％乙醇浸泡2 d，过滤出浸出液，蒸馏后用等体积石油醚脱脂两次，分离得到麦冬总皂苷溶液。按上述过程提取两次，麦冬总皂苷溶液浓缩至1/10体积，备用。
       2.2  麦冬总皂苷的含量测定［8］精密称量对照品3.7 mg于50 ml量瓶中，甲醇定容。精密吸取0.3，0.5，1.0，1.5，2.0 ml标准溶液置于平底烧瓶中，蒸干。加入高氯酸（70.0%～72.0%）10   ml，密塞，65℃水浴加热15 min，冰水停止反应，1～4 h内于295，325 nm波长测定吸收值，高氯酸为空白。以浓度（C）为横坐标，吸收差值（△A）为纵坐标，绘制标准曲线。线性范围2～15 μg/ml，得回归方程。
       
       麦冬总皂苷被测组分按上述步骤，测定295，325 nm波长的吸收值，将吸收差值（△A）代入回归方程可以算得麦冬总皂苷的浓度（C），进而得麦冬总皂苷的含量，计算式如下：麦冬总皂苷含量=麦冬总皂苷浓度×被测麦冬总皂苷体积。
       2.3  AB-8大孔吸附树脂对麦冬总皂苷的静态吸附容量的测定采用静态吸附量实验来确定AB-8大孔吸附树脂对麦冬总皂苷的吸附容量，主要考察单位体积的AB-8湿树脂对麦冬总皂苷的吸附能力。
       
       准确量取经预处理的AB-8湿树脂10 ml置于250 ml具塞三角瓶中，加入100 ml麦冬总皂苷溶液（初始浓度已由标准曲线计算得出），室温下置于振荡器上振荡24 h，充分吸附后，过滤，分别在295，325 nm波长下测定吸附后的麦冬总皂苷的吸光值，得到吸收差值（△A），代入标准曲线方程计算出吸附后麦冬总皂苷的浓度，按下式计算树脂饱和吸附容量(mg/ml)：
       
       饱和吸附容量=(初始浓度-吸附后浓度)×吸附液体积树脂量
       2.4  AB-8大孔吸附树脂乙醇洗脱条件的确定将提取的麦冬总皂苷浓缩液上AB-8大孔吸附树脂，流出液重复吸附4次，用10倍树脂体积的水洗，用10倍树脂体积的乙醇浓度分别为10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%进行梯度洗脱，收集各梯度洗脱组分，定容。由“2.2”项所示方法测定并计算出各乙醇梯度洗脱液中的麦冬总皂苷含量。
       
       以乙醇浓度（%）为横坐标，麦冬总皂苷含量（mg/ml）为纵坐标作图，绘制洗脱曲线，并计算回收率（洗脱皂苷质量/上样皂苷质量），从而确定最佳的乙醇洗脱浓度。
       2.5  薄层层析（TLC）法检测麦冬总皂苷本文采用薄层层析法对不同乙醇浓度梯度洗脱出的麦冬总皂苷进行初步检测。点样量10 μl左右，展开剂为醋酸乙酯∶甲醇∶水 = 5∶8∶0.5。展开后吹干，在10%的H2SO4溶液显色检测麦冬总皂苷斑点分布情况。
       2.6  高效液相色谱（HPLC）法检测麦冬总皂苷仪器为Waters Alliance 2695-2966 DAD，色谱柱为Hypersil ODS2 (4.6 mm×150 mm，5μm)，检验波长218 nm，流速1.0 ml/min，进样量10 μl，柱温35℃。流动相A为乙腈，B为水，梯度洗脱条件如表1。
       表1  梯度洗脱条件（略）
       3  结果
       3.1  标准曲线的绘制由实验方法“2.2”项绘制标准曲线，如图1。由图1可见，在2～15 μg/ml范围内，麦冬皂苷浓度（C）与吸收差值（△A）成线性关系，其线性回归方程为：△A = -0.005 51 + 6.532 45C，相关系数R＝0.999 21，说明麦冬皂苷浓度与吸收差值线性显著相关。
       图1  麦冬总皂苷含量测定的标准曲线（略）
       3.2  AB-8大孔吸附树脂对麦冬总皂苷的静态吸附容量取80%短葶山麦冬皂苷573 mg溶于100 ml纯净水中，按“2.3”项方法进行操作。经“2.2”项方法测定，麦冬皂苷上样前初始浓度为5.330 mg/ml，经AB-8大孔吸附树脂吸附后样品浓度为0.015 mg/ml。最终计算得出AB-8大孔吸附树脂对麦冬皂苷的静态吸附容量为53.16 mg/ml。
       3.3  麦冬总皂苷的提取按照“2.1”项方法，从0.2 kg麦冬粉末中提取得到麦冬总皂苷溶液，浓缩蒸干为粉末状，得到麦冬总皂苷粗品10.91 g，提取率为5.46%。
       3.4  AB-8大孔吸附树脂乙醇洗脱条件的确定在树脂柱中装入预处理后的AB-8大孔吸附树脂10 ml，取提取得到的麦冬总皂苷0.50 g，溶解在100 ml的去离子水中，上柱，流出液重复吸附4次。再依次用离子水100 ml,体积分数10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%的乙醇溶液各100 ml 进行分步梯度洗脱，将不同乙醇浓度的梯度洗脱液分别收集，旋转蒸发后定容至10ml。测定不同乙醇浓度梯度洗脱液中麦冬总皂苷含量，以乙醇浓度为横坐标,麦冬总皂苷含量为纵坐标，绘制洗脱曲线。见图2。
       图2  麦冬总皂苷在不同乙醇浓度下的洗脱曲线（略）
       
       按“2.4”项方法，将10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%乙醇分步梯度洗脱所得的麦冬总皂苷进行薄层层析（TLC）检测，如图3。
       图3  AB-8大孔吸附树脂分离提纯麦冬总皂苷乙醇梯度洗脱液中麦冬总皂苷的薄层色谱图（略）
       
       由图2可见，随着乙醇浓度的加大，洗脱液中的麦冬总皂苷浓度也在增加。乙醇浓度在60%时，洗脱液中的麦冬总皂苷浓度达到最大值，为88.46 mg/ml，之后逐渐下降。80%的乙醇浓度下已将大部分的麦冬总皂苷洗脱下来。
       
       由图3中的薄层层析斑点分布情况和颜色深浅可见，在10％~30％乙醇浓度下麦冬皂苷的洗出量非常少。在50％~80％乙醇浓度下麦冬总皂苷的洗出量明显增加，在80%乙醇浓度洗脱下麦冬总皂苷已基本洗出。至95%乙醇浓度洗脱，斑点数量明显减少，并且组分主要集中在薄层层析Rf 0.883的最顶处，这与图2中得到的结果基本相符。图3中的短葶山麦冬皂苷C的薄层层析斑点对应在Rf 0.520处，从50％~80％乙醇浓度下麦冬总皂苷洗脱出的斑点看，含有短葶山麦冬皂苷C，说明用80％乙醇洗脱就可以洗出包含短葶山麦冬皂苷C在内的麦冬总皂苷。
       
       将10％~80％不同乙醇浓度梯度洗脱液合并，蒸干，得到麦冬总皂苷粉末427.45  mg，经计算回收率为85.49%。
       
       经以上分析，同时考虑到生产中节省乙醇的目的，确定利用AB-8大孔吸附树脂提纯麦冬总皂苷，洗脱液采用80％乙醇溶液。
       3.5  高效液相色谱的定性检测对麦冬总皂苷粗品、短葶山麦冬皂苷C、乙醇浓度为30%、80%和95%梯度洗脱的麦冬总皂苷组分，采用“2.6”项方法，进行了HPLC定性检测。结果如图4~8所示。
       图4  麦冬总皂苷粗品的HPLC图谱（略）
       图5  短葶山麦冬皂苷C的HPLC图谱（略）
       图6  浓度为30%乙醇梯度洗脱组分的HPLC图谱（略）
       图7  浓度为80%乙醇梯度洗脱组分的HPLC图谱（略）
       图8  浓度为95%乙醇梯度洗脱组分的HPLC图谱（略）
       
       由图4，发现麦冬总皂苷粗品中成分较杂，保留时间分别在7.2，8.3，9.7，14.1，18.6，19.2，24.7，26.2，30.0，32.9 min时出现洗脱峰，约10多个峰；30%乙醇梯度洗脱组分的HPLC图谱（图6）中，发现其中含有的组分明显减少，仅在保留洗脱时间14.1，18.6，19.2 min处出现3个峰；80%乙醇梯度洗脱组分的HPLC图谱（图7）中，发现组分有所增加，在保留时间9.7，14.1，18.6，19.2，24.7，26.2，30.0，32.9 min处出现8个峰；95%乙醇梯度洗脱组分的HPLC图谱（图8）中，发现其组分极少，主要含有保留时间为32.9 min的峰。以上说明，当利用AB-8大孔吸附树脂对麦冬总皂苷粗品进行提纯是完全可行的，用80%乙醇洗脱可将原来含有10多个峰的粗品中，提纯到含有8个峰的麦冬总皂苷。
       
       从图6~8中，发现保留时间在18.6和19.2 min的组分随乙醇浓度的加大顺次减少，30％乙醇中最大，80％乙醇中次之，至95％乙醇中几乎没有，说明30%乙醇还无法完全洗脱出这两种组分，只有当乙醇浓度达到80％时，才可将这些组分完全洗脱出来。同样，短葶山麦冬皂苷C（保留时间在30 min）也需要80％乙醇洗脱才可洗脱出来。
       
       需要说明的是，在图8（95%乙醇梯度洗脱组分的HPLC图谱）中各峰看起来很明显，这是为了方便观察分析把纵坐标的数量级放大了10倍，实际上与其它图谱比较的话，其上的峰是很小的，说明95％乙醇梯度洗脱液中麦冬皂苷的含量极低。    从各HPLC图谱中峰高和峰面积比较，以及对照标准品短葶山麦冬皂苷C的HPLC图谱进行比较分析，确认80％乙醇洗脱AB-8大孔吸附树脂，就可将包含短葶山麦冬皂苷C在内的麦冬皂苷洗脱出来，同时也去除了杂质，使麦冬总皂苷的纯度得到了提升。
       4  结论
          
       在麦冬总皂苷的提取中，AB-8大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附和交换容量大、选择性好、吸附和交换速度快、吸附条件温和、再生处理方便、强度好、使用寿命长等优点。本实验利用AB-8大孔吸附树脂提纯麦冬总皂苷，将中药麦冬用酒精提取得到的麦冬总皂苷，经脱糖、除杂处理后得到没有杂质的麦冬总皂苷。利用麦冬总皂苷含量测定的标准曲线对麦冬总皂苷的静态吸附容量进行了测定，其结果为53.16 mg/ml。将麦冬总皂苷经AB-8大孔吸附树脂进行乙醇梯度的分步洗脱，通过分析麦冬总皂苷在不同乙醇浓度下的洗脱曲线、麦冬总皂苷乙醇梯度洗脱液中麦冬总皂苷的薄层色谱图和高效液相色谱的定性检测，结果表明，在利用AB-8大孔吸附树脂提纯麦冬总皂苷中，用80%浓度乙醇洗脱出的麦冬总皂苷量多，回收率为85.49%。
       
       此外“大孔吸附树脂使用安全问题”，即致孔剂和降解物的毒性等也应得到充分考虑。鉴于此国家卫生部也明文规定了“在保健食品中采用大孔吸附树脂工艺的技术要求”，其中就成品中二乙烯苯的残留量应小于50ppb及其检测方法和标准作出了规定。本论文中采用AB-8大孔吸附树脂是天津农药股份有限公司树脂分公司生产的，所用溶剂与酸碱均采用食品级进行预处理，采用顶空进样的气相色谱检测处理后的树脂中残留的二乙烯苯远远低于50ppb。通过实验也发现该大孔吸附树脂对甾体皂苷类化合物有很好的分离纯化作用。论文中得出的相关AB-8大孔吸附树脂工艺条件也必将对今后的研究和生产应用提供科学依据。
       【参考文献】
         　　［1］ 刘吉华,余伯阳.麦冬多糖精制方法的比较［J］.植物资料与环境学报,2003,12(3):55.
       
       ［2］ Xiao Lin,De Sheng Xu,Yi Feng,et al.Determination of Ophiopogon japonicus polysaccharide in plasma by HPLC with modified postcolumn fluorescence derivatization［J］.Analytical Biochemistry,2005,342(2): 179.
       
       ［3］ 易进海.麦冬研究进展［J］.华西药学杂志,1993,8(1):32.
       
       ［4］ 李兰青，张丽娟.麦冬的药理作用［J］.河北中医药学报,2000,15(2):34.
       
       ［5］ 钱斯日古楞，王红英，金凤燮.正交设计研究麦冬皂苷提取工艺［J］.中国药学,2005,27(5):594.
       
       ［6］ Junping Kou, Boyang Yu， Qiang Xu. Inhibitory effects of ethanol extract from Radix Ophiopogon japonicus on venous thrombosis linked with its endothelium-protective and anti-adhesive activities［J］.Vascular Pharmacology, 2005,43(3):157.
       
       ［7］ 姚令文,王钢力,王 峰，等. HPLC-ELSD法测定川麦冬中麦冬皂苷D的含量［J］.中国中草药,2004,14(3):419.
       
       ［8］ 余伯阳，吴 锼，代世俊，等．采用等吸收双波长消去法测定麦冬类皂苷成分［J］.中国药科大学学报，1996，27(5)：316.