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       【摘要】 
       目的优化鬼臼毒素固体脂质纳米粒配方及工艺条件。方法采用正交设计方法对制剂配方及工艺条件进行实验，以表面活性剂含量及表面活性剂成分，固体脂质的含量，搅拌速度为4个因素，固体脂质纳米粒粒径大小为考察指标，筛选出鬼臼毒素固体脂质纳米粒最佳的制剂量配方，并进行形态学和稳定性观察。结果通过对各配方的综合评价进行统计分析研究得出表面活性剂含量为5%，主要成分为Brij78，固体脂质含量为1%，搅拌速度1 000 r/min为最佳制备条件，鬼臼毒素含量为0.5%。结论根据正交实验结果制备的鬼臼毒素固体脂质纳米粒在粒径方面符合要求，且在稳定性、外观方面均较理想。
       【关键词】  正交设计 鬼臼毒素 固体脂质纳米粒
       Study on the Optimum Preparation Condition of the Podophyllotoxin Solid Lipid Nanoparticles with Orthogonal Design
       SHI Yujie, ZENG Kang*，LI Guofeng，ZHANG Min，  GU Dongfeng，YANG Jian
       （Department of Dermatology,Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; Department of Dermatology, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510260,China）
       Abstract：ObjectiveTo select the optimum condition of the podophyllotoxin solid lipid nanopartcles(PODSLN)preparation.MethodsThe optimization of PODSLN preperation was performed based on the orthogonal esperimental design.In this study，the particle size of PODSLN were taken as the index and the influenece of factors such as concentration of surfactant，matrix lipid，the composition of surfactant and agitation velocity were evaluated.ResultsThe best formulation of POD SLN were 5% surfactant (Brij78)，1% matrix lipid and agitation velocity was 1 000 r/min，in which podophyllotoxin was 0.5%.ConclusionThe POD SLN designed according to orthogonal experiment was coincidenced with the requirements in aspect of the particle size and it has been proved to be stable，reasonable and scientific.
       Key words：Orthogonal design;  Podophyllotoxin;  Solid lipid nanoparticles
       
       随着纳米技术在生物工程学及医学领域的不断发展，固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticle，SLN)作为一种新型药物载体制剂，因其良好的组织相容性和靶向缓释特性，成为目前药物治疗和基因治疗的研究热点［1］。人乳头瘤病毒（HPV ）的传播和蔓延是当今困扰医学界的难题之一，在我国其发病率也逐年提高，目前已占我国性传播疾病的第2位。目前治疗HPV感染的药物主要有0.5%鬼臼毒素酊剂、0.5%鬼臼毒素凝胶等制剂，但是其吸收后可引起严重的全身副作用，而且对局部正常组织的刺激性也较大，限制了其临床应用。因此我们设计出靶向性、缓释性的鬼臼毒素新型外用制剂——鬼臼毒素固体脂质纳米粒（Podophyllotoxin solid lipid nanoparticles，PODSLN)，并通过正交实验法优选其基质成分及工艺条件，以进一步提高制剂的质量，优化制备工艺。
       1  材料和仪器
       1.1  试剂鬼臼毒素（陕西德赛高科技生物股份有限公司，纯度98%）；棕榈酸（汕头市西陇化工厂）；卵磷脂（上海太伟药业有限公司）；F68、Brij78(sigma公司）；Myrj53（辽宁奥克纳米材料有限公司，药用规格）；二氯甲烷、乙醇及其他试剂均为国产分析纯。
       
       1.2  仪器Zetasizer 3 000 HS粒径分析仪（Malvern Instruments Ltd，UK)；磁力搅拌器（GL2型 巩仪市英峪华仪器厂）；JB3A 型定时恒温磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）；TMP1 型电子天平（德国制造）
       2  方法
       2.1  考察因素和水平根据文献和预实验结果选择影响配方主要方面的表面活性剂量含量及表面活性剂量成分，固体脂质的含量，搅拌速度为4个因素，每个因素选取3个水平，采用正交表 L9（34）进行筛选。因素水平表见表1。固体脂质纳米粒粒径的大小能够直接影响到制剂的质量和药物疗效，作为经皮给药的固体脂质体，其粒径的大小影响到制剂与皮肤之间的闭塞效应和皮肤渗透能［2］。因此我们以粒径大小作为评价指标对鬼臼毒素 固体脂质纳米粒的制备工艺进行优化。
       表1  正交实验因素水平表（略）
       2.2  鬼臼毒素固体脂质纳米粒的制备参考文献［3］，取处方量卵磷脂，加入适量乙醇，超声使其溶解；精密称取处方量的鬼臼毒素，棕榈酸、十八烷酰胺溶于适量二氯甲烷，两者混合共同构成油相。另取处方量的F68，Brij78或Myrj53加入50 ml 双蒸水中，超声使其充分溶解，构成水相。油相缓慢注入1 000~3 000 r/min搅拌的（75±2) ℃恒温水相中持续搅拌约2~4h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5~15ml。将所行半透明微乳快速混于另一0~4℃的5  ml冰水中，并在冰水中超声1 h，即得鬼臼毒素固体脂质纳米粒混悬液。
       2.3  纳米粒径的测定取制备的鬼臼毒素固体脂质纳米粒混悬液适量，加适量双蒸水稀释后，用Zetasizer 3 000HS型粒径分析仪测定其粒径。
       2.4  形态学观察取根据正交实验结果制备的PODSLN混悬液适量加双蒸水稀释后滴加在覆盖碳膜的铜网上，以2%的磷钨酸钠液负染，在扫描电镜下照片，观察其粒径大小和形态。
       2.5  外观性状及稳定性考察将制成的PODSLN混悬液和空白SLN混悬液装入青霉素小瓶各3份，分别于室温及冰箱（4℃)中 ，在24h， 1个月，3个月，6个月时观察其外观、性状（粘稠度、色泽、亮度、细腻、均匀性等）变化，4 000 r/min离心15 min观察是否分层或出现沉淀。
       2.6  统计方法采用正交设计的方差分析。
       3  结果
       3.1  正交分析实验方案及检测结果见表2~3，方差分析显示A、C、D因素对制剂的质量有影响，差异有统计学意义（P＜0.05)；其中A因素即表面活性剂的含量有极显著影响（P＜0.01)，而B则对制剂的质量无显著性影响。我们的最优方案是A3B2C1D1。即鬼臼毒素固体脂质纳米粒处方中含有表面活性剂量5%，成分为Brij78，固体脂质含量为1%，搅拌速度为1 000 r/min，其中鬼臼毒素含量为0.5%。
       表2  正交实验各评价指标及计算结果（略）
       表3  方差分析（略）
       3.2  形态学观察制备的PODSLN混悬液呈外观均一、稳定的透明胶体状分散体系，电镜下纳米粒呈圆形或卵圆形，粒径大小在43~98nm之间，带银白色乳光。
       3.3  稳定性观察PODSLN样品置4 ℃冰箱6月内仍保持半透明、淡乳色、质地均匀外观，未见沉淀及药物结晶析出，4 000 r/min离心15 min 未发现分层现象。置室温的纳米脂质体混悬液1个月时出现少量混浊，仍均匀，未见药物结晶析出等现象，3~6个月时出现沉淀，有少量药物析出。
       4  讨论
          
       固体脂质纳米粒是20世纪90年代发展起来的一种可替代乳剂、脂质体和聚合纳米粒的新型胶体载药系统［4］。它以固态的天然或合成的类脂为载体，将药物包裹于类脂核中制成。由于载药纳米粒的粒径小，比表面大，对受体组织的黏附性大，给药后滞留性及与组织的接触时间、接触面积均大为增加，从而可提高药物的生物利用度、降低毒性、减少药剂用量［5］。同时由于其粒径较小，可以在皮肤表面形成由紧密排列的球体组成的连贯性的膜，形成闭塞效应［6］，闭塞效应可以通过增加角质层的水合作用，减少水分蒸发来促进药物在皮肤的渗透。
       
       在采用超声乳化法制备PODSLN的过程中，有机溶剂的含量、温度、pH值以及乳化、搅拌时间等因素都会影响最后制剂的质量，但我们在预实验中发现这些并不是主要的影响因素。因此我们选择影响配方主要方面的表面活性剂的含量、成分，固体脂质的含量以及搅拌速度为四个因素，采用正交实验法对鬼臼毒素纳米脂质体制备配方进行了优化，结果在考察范围内，方差分析表明，B因素即表面活性剂量的成分对制剂量没有显著影响；而A、C、D因素对制剂的质量有影响，其中A因素即表面活性剂的含量对制剂影响显著。
       
       表而活性剂的选择在SLN的制备过程中起着重要作用，表面活性剂在溶液表面聚集吸附，从而改变溶液表面的性质，使油水之间表现出较低的表面张力和表面自由能。表面活性剂在粒子周围有规律的排列成膜，随之产生较好的润湿性、乳化性，因此形成的固体纳米粒有较小的粒径和较好的稳定性。表面活性剂量分为阳离子型、阴离子型、两性离子及非离子型表面活性剂，其中非离子型表面活性剂的毒性最小，我们选用的F68，Brij78，Myrj53均为非离子型表面活性剂。最终确定最优配方方案是A3B2C1D1，即鬼臼毒素纳米脂质体含有表面活性剂量5%，成分为Brij78，固体脂质含量为1%，搅拌速度为1 000 r/min，鬼臼毒素含量为0.5%。我们根据正交实验结果表明制备的PODSLN经过电镜和稳定性考察，外观均一，粒径大小符合要求，稳定性好，从而可以获得质量更高的产品，为将来制剂的大规模生产奠定基础。
       【参考文献】
         　　［1］ Bejjani RA， Ben Ezra D，Cohen H，et al.Nanoparticles for gene delivery to retinal pigment epithelial cells［J］.Mol Vis，2005，11:124.
       
       ［2］ Wissing S，Lippacher A，Muller RH.Investigation on the occlusive properties of solid lipid nanoparticles(SLN)［J］.J Cosmet Sci，2001，52(5):313.
       
       ［3］ 谢方明，曾 抗，李国锋，等.鬼臼毒素硬脂酸固体脂质纳米粒的制备［J］.第一军医大学学报，2005，25（1）：99.
       
       ［4］ Muller RH，Keck CM.Challenges and solutions for the delivery of biotech drugsa review of drug nanocrystal technology and lipid nanoparticles［J］.J Biotehnol，2004，113(13):151.
       
       ［5］ 张阳德.我国纳米生物技术的医学应用及研究进展［J］.中国医学科学院学报，2006，28（4）：579.
       
       ［6］ Jenning V，Gysler A，SchaferKorting M，et al.Vitamin A loaded solid lipid nanoparticles for topical use:occlusive properties and drug targeting to the upper skin［J］.Eur J Pharm Biopharm，2000，49(3):211.