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       【摘要】 
       目的优选芪明颗粒的最佳提取工艺条件。 方法芪明颗粒采取醇提的工艺路线，以葛根素、黄酮类、总氮含量为评价指标，对影响醇提的因素醇浓度、用量、提取温度、时间进行L9（34）正交实验设计。 结果醇提最佳提取工艺为药材加8倍量的65%乙醇，90℃回流2 h。结论优选得到的提取工艺稳定可行。
       【关键词】  芪明颗粒 葛根素 黄酮类 总氮 正交实验
       Optimization of  the Extraction Process of  Youtangming Granules by Orthogonal  Design
       ZHANG Linhui, WU Yongjiang*, XIE Xiuqiong
       （College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; Zhejiang Wanma Pharmaceu tical Co. Ltd, Hangzhou 310011, China; Chengdu TCM University, Chengdu 611137, China）
       Abstract：ObjectiveTo study the best extraction process of Qiming granules.MethodsUsing the content of puerarin, flavonoids and total nitrogenand as an assessing index to determine the optimum extraction conditions. Content of ethanol，amount of ethanol，extracting temperature and extracting time  were selected by orthogonal design and the analysis of variance.ResultsThe optimum conditions for the extraction of puerarin,flavonoids  and total nitrogen were  65%  ethanol，which was 8 times of the amount of herb material ，refluxed 2 hours at 90℃.ConclusionThe optimal extraction process is steady and reliable.
       Key words： Qiming granules；  Puerarin；  Flavonoids；  Total nitrogen；   Orthogonal design
       
       芪明颗粒为新研制的六类新药，含有黄芪、葛根、蒲黄、水蛭、地黄等多种成分。黄芪含有黄芪甲苷和黄芪多糖等有效成分，可保肝、降血糖、补气，有增强肌体免疫功能。葛根的主要成分为葛根素，具有改善血液流变性、提高胰岛素受体的敏感性和抑制蛋白质糖基化等作用；地黄主要成分为梓醇，具有降血糖作用；水蛭含有水蛭素、抗血栓素和多种氨基酸、具有很强的活血化淤作用。临床试验表明，芪明颗粒能有效治疗气阴两虚、肝肾不足、血行淤滞的糖尿病性视网膜病变。本实验采用醇提的提取方式，取影响醇提的主要因素即醇浓度、用量、提取温度和时间4个因素，各取3个水平进行L9（34）正交实验，以芪明颗粒中有效成份总氮、总黄酮和葛根素含量为评价指标，筛选醇提最佳工艺［1，2］。
       1  仪器与药品
       1.1  仪器岛津LC10Atvp高效液相色谱仪，BECKMAN DU2640型分光光度计(美国)，SK250 LH型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)， GSYⅡ恒温水浴锅（北京医疗器械厂），电热恒温干燥箱（杭州诺丁科学器材有限公司），211D电子分析天平（德国sartorius）以及常用的常规仪器等。
       1.2  药品与试剂葛根素对照品( 批号：752200108；中国药品生物制品鉴定所）活性炭，醋酸乙酯（AR），乙腈（色谱纯），枸橼酸（AR），黄芪等饮片均购自浙江省临安市医药药材公司。
       2  方法与结果
        
       2.1    正交试验设计  在影响醇提的因素中，醇浓度、用量、提取时间，提取次数及提取温度为较重要的5个因素，考虑到实际操作的安全性，醇提次数定为1次，故选定乙醇浓度、用量、提取温度与时间作为考察因素，以葛根素、黄酮类、总氮含量为指标，应用L9（34）正交实验设计进行试验。因素水平安排见表1。
       2.2  样品溶液的制备按处方称取药材50 g，按正交表条件提取，回收乙醇至每毫升药液相当于0.5 g生药，备用。
       2.3  葛根素含量测定方法
       2.3.1  色谱条件 色谱柱为ODS C18 （25 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为0.1%枸橼酸溶液甲醇（75:25）；检测波长250 nm；柱温30℃；流速1.0ml/min。
       表1  因素水平（略）
       2.3.2  标准曲线的绘制取干燥恒重的葛根素对照品适量，精密称定，加水溶解，稀释制成不同浓度溶液，各精密吸取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为A=48 843.8C+13 322  r=0.999 99，结果表明在22.4~222 μg/ml范围内葛根素的浓度与峰面积呈良好的线性关系。
        
       2.3.3  样品溶液的预处理及测定精密吸取样品20 ml，水浴蒸干，残渣置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50 ml，塞紧，称定重量，超声波提取30 min，放冷，称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀。将乙醇提取液上于中性氧化铝柱（湿法装柱，3~5 g）上，50％乙醇洗脱定容，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。
       2.3.4  回收率实验采用加样回收法，取已知含量的芪明颗粒5份，分别添加葛根素对照品适量，制成供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果平均回收率为99.682，RSD为0.214%。
       2.3.5  精密度实验  精密吸取对照品溶液20 μl，重复进样6次测定葛根素含量，计算相对标准偏差为RSD=1.75%。
       2.3.6  稳定性实验分别取同一份供试品溶液20μl，按0，2，4，6，8 h时间间隔，分别进样分析，测定色谱峰面积，RSD为1.98%，测定结果显示，在8 h内，供试品中葛根素含量基本稳定。
       2.4  黄酮类含量测定方法
       2.4.1  标准曲线的制备精密称取芦丁对照品20.8 mg（120℃干燥，恒重），置100 ml量瓶中，加乙醇50 ml ，水浴微热使溶解，稀释至刻度，摇匀。精密称取上述溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml，分别置于10ml容量瓶中，各精密加入5%NaNO2溶液0.3ml，摇匀，放置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.3 ml，摇匀，放置6  min，再加入1mol/L NaOH溶液4 ml，蒸馏水定容，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，于500 nm波长处测吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为：A=0.021 6+9.051 7C，r=0.999 5，线性范围20.8~62.4 μg。
       2.4.2  供试品溶液的制备精密量取20μl提取液，加HCl调pH1~2，沸水浴水解20 min，醋酸乙酯萃取4次（30 ml，20 ml×3），合并醋酸乙酯层，水浴挥干，残渣用乙醇溶解，滤过，定容至25 ml。
       2.4.3  精密度实验精密吸取芦丁对照品溶液(0.208 0 mg/ml)2.0 ml，5份，按“2.4.1”项下的操作，分别测定500 nm处的吸光度，计算得RSD= 1.14%
       2.4.4  测定法精密吸取上述溶液1 ml，置10 ml容量瓶中，按“2.4.1”项下“各精密加入5%NaNO2”起，依法测定吸光度，由标准曲线求得样品中黄酮类含量。
       2.5  总氮含量测定方法  精密吸取样品溶液0.5 ml，按《中国药典》Ⅰ部（2005）版附录ⅨL氮测定第2法（半微量法）测定，每1毫升硫酸滴定液（0.005mol/L）相当于0.140 1 mg的N。
       2.6  正交实验结果正交实验结果见表2。利用SAS软件对正交结果做方差分析，所得方差分析结果见表3。据表2的极差分析可知，在所考察的影响因素中，重要性依次为A＞C＞B＞D。A因素中A1＞A2＞A3，B因素中B2＞B1＞B3，C因素中C2＞C3＞C1，D因素中D2＞D1＞D3。由于SSd最小，故以其作为误差进行方差分析。方差分析结果表明，A因素、C因素的影响有显著性意义（P＜0.05）；Ｂ因素、D因素的影响无显著意义。根据方差分析结果，结合生产成本考虑，确定最佳提取条件为A1C2B1D2，即加8倍量65%乙醇90℃提取2 h。
       表2  醇提正交实验结果（略）
       3个评价指标，采用综合评分法进行数据分析，葛根素、总黄酮、总氮均为有效成分的指标反映，故各给予0.33的加权值。各指标评分=含指标量/最大指标含量×100×0.33
       表3  结果方差分析（略）
       2.7  验证实验结果 按处方称取药材90 g，用筛选出的醇提工艺条件，即8倍量65%乙醇90℃提取2 h，测定各评价指标的量。(见表4)，由表4结果可以看出正交设计筛选出的工艺是合理的。
       表4  验证实验结果（略）
       3  讨论
          
       由于芪明为新药处方，为最大程度的优化提取工艺，实验中选取了多个成分作为评价指标。在测葛根素含量时，为确保样品成分能得到有效的分离，样品溶液统一经过样品前处理（过中性氧化铝柱，用50%乙醇洗脱），并先后采用甲醇- 水 ( 25∶75) (Ⅰ) ，0.1%枸橼酸溶液-甲醇 (75∶25) ( Ⅱ) 为流动相进行比较分析，在系统(Ⅱ)的条件下，供试溶液中葛根素与相邻组分分离度良好，阴性样品无干扰，故确立系统(Ⅱ)为流动相系。色谱柱采用ODS C18 （15 mm×4.6 mm，5μm）时，理论板数不够，当采用ODS C18 （25 mm×4.6 mm，5μm），能达到有效理论板数；测总黄酮含量时，为消除其他杂质的干扰，样品溶液先经活性炭脱色，因黄酮类成分在醋酸乙醋中溶解得很好，故用醋酸乙醋萃取以消除非黄酮类脂溶性物质。紫外分光光度仪上扫描结果显示在500 nm波长处，黄酮类样品有最大吸收。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京: 化学工业出版社，2005: 233.
       
       ［2］ 赖毅勤，周虹兵.近年来黄酮类化合物提取和分离方法研究进展［J］.食品与药品，2007，9（4）：54.