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       【摘要】 
       目的建立周氏回生丸的质量标准，包括定性鉴别和定量含测两部分。方法采用TLC法对丁香、木香、檀香、麝香、甘草、山慈姑进行定性鉴别；采用高效液相色谱法对制剂中没食子酸的含量进行定量测定。结果在TLC色谱中能检测出丁香、木香、檀香、麝香、甘草、山慈姑6味药材；建立的含量测定方法中，没食子酸的线性范围为9.16～91.6 μg/ml，平均回收率分别为99.3％。结论所建立的定性、定量方法准确可行，重复性好，可作为周氏回生丸的质量标准。
       【关键词】  周氏回生丸 质量标准 薄层色谱 高效液相色谱 没食子酸
       Studies on Quality Standard of Zhoshihuisheng Pills
       TIAN Chengwang， ZHANG Tiejun，MA Xiaojie,TANG Cheng
       (Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300193,China；Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193,China；Tianjin Medical University，Tianjin 300193,China)
       Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard of Zhoshihuisheng Pills including qualitative analysis and quantitative measurement.MethodsFlos Caryophylli,Radix Aucklandiae,Lignum Santali Albi,Moschus,Radix et Rhizoma Glycyrrhizae, pseudobulbus cremastrae seu pleiones were qualitatively analyzed by TLC. Gallic acid was quantitatively measured by HPLC. ResultsFlos caryophylli,radix aucklandiae,lignum santali albi,moschus,radix et rhizoma glycyrrhizae,pseudobulbus cremastrae seu pleiones could be identified by TLC. The linear relationship was in the range of 9.16～91.6 μg/ml for gallic acid, and the average recovery was 99.29％.ConclusionThis method is accurate and highly reproducible．It can be used for the quality control of Zhoshihuisheng pills．
       Key words：Zhoshihuisheng Pill；  Quality standard；  TLC；  HPLC；  Gallic acid
       
       周氏回生丸是由五倍子、沉香、檀香、麝香、丁香、千金子霜、六神曲、冰片、红大戟、朱砂、甘草、山慈姑、雄黄等14味中药组成的复方制剂，具有祛暑散寒、解毒辟秽、化湿止痛的功效，用于寒霍乱、干霍乱、痧胀。质量标准收载于1998年部颁标准 (WS3-B-3235-98) 中。在原标准和相关文献报道的基础上［1~4］，本研究采用TLC法对周氏回生丸中的丁香、木香、檀香、麝香、甘草、山慈姑等主要药味进行定性鉴别，同时采用HPLC法对制剂中的没食子酸含量进行测定，为该制剂的质量控制提供保证。
       1  仪器与试药
          
       Dionex高效液相色谱仪，UVD 170U，Chromeleon色谱工作站；电子天平（METTLER TOLEDO）；超声仪（Autoscience AS3120，功率120W，频率40kHz）。硅胶G板、GF254板(青岛海洋化工厂)；甲醇为色谱纯；甲醇、三氯甲烷、乙醚、醋酸乙酯等试剂均为分析纯。
       
       麝香酮对照品(批号110719-200409)、甘草苷对照品(批号111610-200604)、没食子酸对照品(批号110831-200302)均由中国药品生物制品检定所提供；周氏回生丸，购自天津安舜大药房（批号为070201，070202，070203）；丁香、木香、檀香、麝香、甘草、山慈姑等药材购自天津安舜大药房，经天津药物研究院张铁军研究员鉴定为正品。
       2  方法与结果
       2.1  薄层鉴别研究
       2.1.1  丁香的薄层鉴别取本品细粉5 g，加乙醚30 ml，水浴回流提取1 h，过滤，滤液蒸干，加1 ml甲醇使溶解，作为供试品溶液；取丁香对照药材0.1 g，按供试品溶液的制备方法制得对照药材溶液；取缺丁香的其它药材制成的阴性样品5 g，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法实验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液液、阴性对照溶液各5 μl，点于同一块硅胶GF254板上，以甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸( 9∶4∶2 )为展开剂，展开，取出，晾干，于紫外254 nm下检视。供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图1。
       2.1.2  木香的鉴别取本品细粉3 g，加乙醚30 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，加乙醚1 ml使溶解，作为供试品溶液；取木香药材细粉0.5 g，按供试品溶液的制备方法进行制备，作为对照药材溶液；取缺木香的其它药材制成的阴性样品3 g，按照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法实验，吸取上述供试品溶液、阴性样品溶液、木香对照药材溶液各5 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-环己烷( 5∶2 )为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液显色，吹干，吹至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图1。
       2.1.3  檀香的鉴别取本品细粉40 g，加200 ml蒸馏水，置挥发油提取器中，回流提取3 h，收集挥发油，挥发油加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液；取檀香细粉1 g，按供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；取缺檀香的其它药材制成的阴性样品10 g，按照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法实验，吸取上述供试品溶液、阴性样品溶液、对照药材溶液各10 μl，点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚-二氯甲烷-醋酸乙酯( 6∶1∶0.25 )为展开剂，展开，取出，晾干，喷以对二甲氨基苯甲醛溶液，热风吹至斑点清晰。在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图1。
       图1  周氏回生丸中丁香、木香、檀香的TLC图谱（略）
       2.1.4  麝香的鉴别取本品细粉10 g，加乙醚50 ml，水浴回流提取1 h，过滤，滤液蒸干，加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液；取麝香酮对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液；取麝香药材细粉0.1 g，按供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；取麝香阴性样品20 g，按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法实验，吸取上述对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各5   μl，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-环己烷(3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼试液，热风吹至斑点清晰。在供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。见图2。
       2.1.5  甘草的鉴别取本品细粉5 g，加甲醇50 ml，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 ml使溶解，转移至分液漏斗中，加乙醚萃取3次，20 ml/次，弃去乙醚层，水层用水饱和正丁醇萃取3次，20 ml/次，合并正丁醇层，水浴蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液；取甘草苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.6 mg的溶液，作为甘草苷对照品溶液；取甘草对照药材0.5 g，按供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；取缺甘草的其它药材制成的阴性样品5 g，按照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法实验，吸取上述供试品溶液、阴性样品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各5 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇( 5∶1 )为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至显色清晰。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图2。
       2.1.6  山慈姑的鉴别取本品细粉（过50目筛）20 g，加pH=2的盐酸30 ml，超声30 min，过滤，滤液用10%的氢氧化钠调节到pH=10，再用醋酸乙酯进行萃取3次，30 ml/次，将醋酸乙酯层蒸干，加1 ml甲醇使溶解，作为供试品溶液；取山慈姑对照药材0.5 g，按照供试品溶液的制备方法制得对照药材溶液；取缺山慈姑的其它药材制成的阴性样品10g，按照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。 照薄层色谱法实验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各10 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶8∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液显色，热风吹至斑点清晰。供试品色谱中，在与山慈姑对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图2。
       图2  周氏回生丸中麝香、甘草、山慈姑的TLC图谱（略）
       2.2  含量测定研究
       2.2.1  色谱条件色谱柱为Diomand TM C18(200 mm×4.6 mm，10μm)，流动相为甲醇-0.1％磷酸(5∶95)，流速1.0 ml/min，检测波长273 nm，柱温30 ℃，理论塔板数按没食子酸峰不低于3 000。色谱图见图3。
       2.2.2  对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品适量，用甲醇溶解制成91.6 μg/ml的对照品溶液，0.45 μm滤过，即得。
       2.2.3  供试品溶液的制备取本品粉末0.15 g，精密称定，加入4 mol/L的盐酸50 ml，加热回流提取3.5 h，冷却，过滤，精密移取1 ml置5 ml容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
       2.2.4  线性关系考察实验将上述对照品溶液稀释成不同的浓度，依次进样10μl，以色谱峰面积对没食子酸溶液的浓度作图，并进行回归统计，得到没食子酸的回归方程为Y=25.853X-4.555 3,r=0.999 9，线性范围为9.16～91.6 μg/ml。
       2.2.5  精密度实验精密量取上述对照品溶液10 μl，连续进样6次，测得没食子酸的峰面积RSD为0.16％，表明进样精密度良好。
       2.2.6  重复性实验取070201批样品，按供试品溶液的制备方法制得6份供试品溶液，精密量取10 μl，进样，测得没食子酸的峰面积RSD为0.81%，表明该方法的重复性良好。
       2.2.7  稳定性实验取070201批样品，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，室温放置，在0，2，4，8，12，24 h进样测定，测得没食子酸的峰面积RSD为0.84%，表明样品溶液在24 h内稳定。
       图3  没食子酸HPLC色谱图（略）
       2.2.8  回收率实验取已知含量的周氏回生丸（每克含76.02 mg的没食子酸）6份，每份0.075 g，分别置于具塞锥形瓶中，准确加入2.81 mg ·ml-1的没食子酸对照品溶液各1 ml，按“2.2.3”项下方法制得各供试品溶液。在上述色谱条件下测定，测得没食子酸的平均回收率(n=6)为99.3%，RSD值为1.81%。
       2.2.9  样品含量测定取周氏回生丸样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，按外标法计算含量，测得3批（批号070201，070202，070203）中没食子酸的含量分别为7.57％，7.52％和7.51％（n＝3）。
       3  讨论
          
       本制剂由14味中药组成，成分比较复杂。为了更好地控制成品的质量，我们采用薄层色谱鉴别法对其中的6味主要药材进行了鉴别。通过对色谱条件进行优化，并经3批样品实验证明，该方法简便易行，斑点分离清晰，重现性好，阴性对照无干扰可作为该制剂的质量控制的方法。
       
       本品为中药复方制剂，五倍子为本品的君药，没食子酸为其主要活性成分，故选择没食子酸作为评价本品质量的指标成分。《中国药典》2005版给出了五倍子中的没食子酸含量测定方法，用于本制剂中，色谱分离度不好，且取样量太大，不利于样品回收率的测定。本研究优化了流动相比例、柱温等色谱条件，并确定了合适的供试品溶液制备方法。该色谱条件下，色谱峰分离度良好，阴性无干扰，且方法简单易行，结果可靠，重复性好。
       【参考文献】
         　　［1］ 李泽友，潘 扬，丁 岗. 木香药材中木香羟内酯和去氢木香内酯的定性和定量研究［J］.时珍国医医药，2004，15(11)：745.
       
       ［2］ 闻绍春，徐 华，高 钢. 冠心七味滴丸中檀香与降香的薄层色谱鉴别研究［J］.内蒙古医学杂志，2005，37(12):1152.
       
       ［3］ 冯国庆，党晓菊，邹恩济，等.薄层扫描法测定蒙药扎冲注射液中麝香酮含量［J］.中国民族医药杂志，1999，5(4):39.
       
       ［4］ 蒋艳玲，袁卫梅，李宇翠. 薄层扫描法测定麝香保心丸中麝香酮的含量［J］.河南中医药学刊，2002，17(4)：21.