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       【摘要】 
       目的研究气阴双补法对干燥综合征小鼠的作用。方法将60只Bacb/C小鼠，按体质量随机分为6组，每组10只，即正常组，模型组，羟氯喹组，增液布津汤小剂量组、中剂量组和大剂量组。对照组用羟氯喹片剂，观察体质量、摄食量、饮水量、唾液流量、脾指数及颌下腺病理形态学变化。结果增液布津汤能有效缓解口干、口腔烧灼感、眼干、眼异物感、鼻干等临床症状。实验室检查方面能增加唾液流量及泪流量，病理显示能抑制淋巴细胞浸润。结论运用气阴双补不仅能缓解干燥综合征小鼠临床症状，而且能纠正免疫紊乱,疗效优于对照组。
       【关键词】  气阴双补； 干燥综合征； 小鼠
       al Research of the Method of Nourishing Both "Qi" and Blood on the Mice Having SS
       JIN Guilan, WANG Yue
       Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210046, China
       Abstract：ObjectiveTo research the function of the method of nourishing both "qi" and blood on the mice having SS.MethodsPut the 60 Bacb/C mice into 6 groups according to their weight at random, there were 10 mice in each group.The groups included the normal group, the model group, the hydroxychloroquine group, the low, middle and high dose group using Zengye Bujin Decoction. We used hydroxychloroquine tablets on the mice in the control group and then observed the index weight, food intake, water intake, salivary flow rate, spleen index and the pathomorphology observation of submandibular gland.ResultsZengye Bujin Decoction could effectively relieve dry mouth, burning mouth sensation, dry eye, eye foreign body sensation, dry nose and some other clinical symptoms. The examination of lab showed it could increase salivary flow rate and tear flow rate. Pathology also showed it could restrain the infiltration of lymphocyte.ConclusionThe use of the method of nourishing both "qi" and blood can not only relieve the clinical symptoms of the mice having SS, but also correct immunologic derangement, whose efficacy is better than those in the control group.
       Key words：Nourishing both "qi" and blood ；  SS；  Mice；  Experimental research
        干燥综合征(Sjogren′s syndrome，SS)是一种侵犯外分泌腺体（尤以唾液腺和泪腺为主）的慢性自身免疫病。本病病因可能与遗传、免疫、性激素、内分泌和病毒感染等因素有关。中医学无此病名，根据其发病及临床特征，将之归属祖国医学“燥证”“燥痹”范畴。金元时期，刘河间在《素问玄机原病式·燥类》中指出：“诸涩枯涸，干则皴揭，皆属于燥”；并创立麦门冬饮子以治之。明清以后，各家对燥证已论述颇多，均从不同角度对燥证进行了较系统的探讨和研究。最具代表性的是清代喻嘉言，认为除燥伤于外皮肤皴揭之外，燥伤于内而致的精血枯涸亦属于燥证范畴，并根据刘河间“风热胜湿为燥”的理论提出了辛凉甘润法治疗燥证，代表方剂为著名的清燥救肺汤。然而，从临床研究发现，SS除与阴虚燥毒有关外，与气虚因素密切相关，运用气阴双补法对干燥综合征小鼠实验研究，通过研究其对小鼠的干预作用，旨在为临床治疗提供确切依据。
       1  材料与仪器
       1.1  动物12周龄Bacb/C小鼠，60只，18～22 g，雌性，由南京青龙山实验动物中心提供。
       1.2  药品增液布津汤，由南京中医药大学药学院制剂研究室提供；
       
       硫酸羟氯喹（hydroxychloroquine，HCQ），上海中西制药有限公司，批号：040501。
       1.3  试剂弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，SIGMA，USA，Lot：075K8915；吸附无细胞百日咳、白喉、破伤风联合疫苗，成都生物制品研究所，批号：200503171。PBS磷酸盐缓冲液，0.01M，pH7.2～7.4，中杉金桥，批号：ZLI9061；牛血清白蛋白，南京生兴生物技术有限公司，Amresco分装，Lot：1105S02；Mouse IFNγ ELISA KIT，晶美生物工程有限公司，Lot：FMK0003；Mouse IL4 ELISA KIT，晶美生物工程有限公司，Lot：FMK0005。
       1.4  仪器FA2104上皿电子天平，上海精科；XW80A涡旋混合器，上海医科大学仪器厂；Eppendorf 5417R高速低温冷冻离心机；LDZ52型离心机，北京医用离心机厂；FSHII型高速电动匀浆器，江苏金坛振华仪器厂；TU1800S紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PYXDH540X50隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；TEB微量振荡器，姜堰市康泰医疗器械厂；BIORAD 3550酶标仪，MICROPALTE READER。
       2  方法
       2.1  分组及给药60只Bacb/C小鼠，按体重随机分为6组，每组10只。临用前分别将上述药物用生理盐水配成以下浓度：正常组：生理盐水10 ml/kg；模型组：生理盐水10 ml/kg；羟氯喹组：0.1 g/kg；增液布津汤小剂量组： 0.05 g/ kg；增液布津汤中剂量组：0.075 g/ kg；增液布津汤大剂量组：0.10 g/ kg。且小鼠灌胃体积为10 ml/kg。各组均在第0天即开始给药。
       2.2  抗原的制备取8只Bacb/C小鼠，脱颈椎处死，75%酒精浸泡10 min，在无菌操作台上解剖颈部，取出两侧颌下腺，分离包膜及结缔组织，用氯化钠注射液洗净，置无菌滤纸上吸干，称重，用显微剪剪碎，每0.1 g置入10 ml无菌试管中，加氯化钠注射液2 ml，在冰浴中用匀浆器以5 000 r/min匀浆20 s，4℃低温离心机中3 000 r/min离心20 min，弃去上层脂质，吸出上清液，置10 ml无菌试管中，以上操作均在低温下进行。
       2.3  Lowry法蛋白定量
       2.3.1  溶液配制溶液A：0.5 g CuSO4·H2O、1 g C4H4O6KNa·4H2O加重蒸水至100 ml；溶液B：2 g Na2CO3、0.4 g NaOH加重蒸水至100 ml；溶液C：1 ml溶液A加50 ml溶液B，混匀；溶液D：10 ml Folin酚试剂加10 ml重蒸水混匀。
       2.3.2  检测精密吸取样品溶液1 ml，加入5 ml溶液C，混匀，在室温下放置10 min，加0.5 ml溶液D，混匀，30 min后以分光光度计测定吸光值，检测波长为650 nm。
       2.3.3  标准曲线的制备分别精密吸取1.0 ml系列对照品溶液于具塞试管中，以1.0 ml蒸馏水作空白对照，Lowry法测定，用752紫外可见分光光度计在650 nm波长处测定吸收度。以牛血清蛋白对照品浓度（C）为横坐标，吸收度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算蛋白含量。
       2.4  SS小鼠模型的制备用灭菌PBS将抗原稀释成800 μg/ml，加等量弗氏完全佐剂，使抗原变为400 μg/ml的油水混合乳剂，第0天，模型组、羟氯喹组、大、中、小剂量组小鼠每侧腹股沟酒精消毒后注射0.05 ml，即每只小鼠注射0.1 ml抗原。第14天，用弗氏不完全佐剂将抗原调整为400 μg/ml，小鼠每侧腹股沟酒精消毒后注射0.05 ml。正常组小鼠注射0.1 ml PBS加佐剂。在第2天及第7天，各只小鼠腹腔注射0.05 ml白百破联合疫苗。
       2.5  检测指标
       2.5.1  小鼠体质量、摄食量、饮水量的测定每2天称小鼠体质量，每2天加饲料100 g，加水100 ml，2 d后称量剩余饲料量及水量，投入的饲料量或水量分别减去剩余饲料量或剩余水量即为每2天每笼小鼠摄食量及饮水量。
       2.5.2  小鼠唾液流量的测定每周测定每只小鼠唾液流量，测定前禁食1 h，不禁水。测定前做好棉球称干重，重量范围4.5～5.0 mg。测唾液分泌时将已经称好干重的棉球放入实验小鼠口颊内，5 min后取出，电子天平上称湿重。
        唾液分泌量（mg）＝湿重－干重
       2.5.3  脾指数、颌下腺指数的测定于实验结束，小鼠眼眶取血后脱颈椎处死，取血，3 000 r/min离心10 min，取血清用于细胞因子测定。取脾及颌下腺称重。
        脾指数＝脾重量（g）÷小鼠体重（g）×1 000
        颌下腺指数＝颌下腺重量（g）÷小鼠体重（g）×1 000
       2.5.4  小鼠外周血中T淋巴细胞亚群 检测小鼠眼眶取血后脱颈椎处死，取血，流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群CD3＋，CD4＋，CD8＋。
       3  结果
       3.1  体质量正常组小鼠体质量稳定，缓慢增加，其他组均在第1次免疫后6～8 d开始体重出现减轻，与正常组有显著性差异，模型组体质量持续下降，给药组体质量亦持续下降，但给药后小鼠体质量维持在较稳定水平，羟氯喹、增液布津汤小、中、大剂量组分别在第24，20，16天与模型组比较出现显著性差异。结果见表1。表1  增液布津汤对SS小鼠体质量的影响 (略)
       3.2  摄食量正常组小鼠摄食量在实验期间维持稳定，而接受抗原注射的小鼠摄食量减少，从第6天起较为明显，而增液布津汤对小鼠摄食量无影响，与模型组比较无差异。结果见表2。表2  增液布津汤 对SS小鼠摄食量的影响 (略)
       3.3  饮水量在实验初各组小鼠饮水量无差异，在接受抗原注射第12天后小鼠饮水量出现明显增加，模型组小鼠饮水量持续上升直至实验末，而羟氯喹和中药能在一定程度上降低SS小鼠饮水量并维持在一定水平。结果见表3。表3  增液布津汤对SS小鼠饮水量的影响 (略)
       3.4  唾液流量在实验适应期及免疫后第1周各组小鼠唾液流量无差异，从第2周起，模型组小鼠唾液流量与正常组比较显著降低，并逐渐降低，而给予羟氯喹和中药后，能增加SS小鼠唾液流量，分别在第4，3，2周与模型组比较有显著性差异。结果见表4。表4  增液布津汤对SS小鼠唾液流量的影响 (略)
       3.5  脾重、脾指数模型组小鼠脾重、脾指数与正常组比较均显著增加，而给予药物后，均能显著降低SS小鼠的脾重、脾指数。结果见表5。表5  增液布津汤对SS小鼠脾重、脾指数的影响 (略)
       3.6  颌下腺重、颌下腺指数模型组小鼠颌下腺重、颌下腺指数与正常组比较均显著增加，而给予药物后，均能显著降低SS小鼠的颌下腺重、颌下腺指数。结果见表6。表6  增液布津汤对SS小鼠颌下腺重、颌下腺指数的影响 (略)
       3.7  小鼠外周血中T淋巴细胞亚群的比较小鼠外周血T淋巴细胞亚群的比较，各组CD3+CD4+/CD3+CD8+值均在正常范围内，但模型组比值最低，西药组作用变化不明显，而中药组比值有一定提高，说明中药组对CD3+CD4+/CD3+CD8+有一定的调节作用。见表7。表7  小鼠外周血T淋巴细胞亚群的比较 (略)
       4  讨论
        运用气阴双补法治疗干燥综合征小鼠，增液布津汤能明显改善小鼠口干、体重减轻情况，增加唾液流量、脾重、脾指数，颌下腺重、颌下腺指数也明显增加，而中药对饮食量影响不大。对小鼠外周血 T淋巴细胞亚群CD3+CD4+/CD3+CD8+有一定的调节作用。
       4.1  组方分析增液布津汤由麦冬、黄芪、太子参、枸杞子、生地、赤白芍、桃仁、紫菀9味药物组成。方中重用麦冬为君药。古人云：“治火可用苦寒，治燥必用甘寒”。麦冬味甘，性微寒。色兼黄白，能入胃以养胃液，入脾以助脾散精于肺，引肺气清肃下行，统调水道以归膀胱。升降濡润之中，兼具开通之力。达清热滋阴润燥之旨，防燥热阴伤之患。重用黄芪为君药。黄芪性味与归经：甘，微温，归肺、脾经，具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌功效。明《本草纲目》载：“耆长也，黄芪色黄，为补者之长故名……”。《本草汇言》载：“黄芪，补肺健脾，卫实敛汗，驱风运毒之药也……。《本草逢原》载：“黄芪能补五脏诸虚 ，治脉弦自汗，泻阴火，去肺热，无汗则发，有汗则止。”本病肺脾之气俱虚，运用黄芪能达补肺健脾之效。
       
       太子参为臣药，性甘、微苦、平，归脾、肺经，具有补气健脾、生津润肺功效。能补脾肺之气，兼能养阴生津，其性略偏寒凉，属补气药中的清补之品。枸杞子为臣药，甘，平，归肝、肾经，滋补肝肾，益精明目。用于虚劳精亏，腰膝酸痛，眩晕耳鸣，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明。明代《药鉴》指出：枸杞子“滋阴，不致阴衰……”。生地黄味甘、苦，性寒，归心、肝、肺经，既能凉血，又能滋阴，具清热滋阴、凉血止血、生津止渴的功效。在《神农本草经》记载生地黄能“逐血痹”“除寒热积聚”“除痹”，《珍珠囊》中记载：“生地黄凉血，生血，补肾水真阴”，“为清热凉血养阴生津之要药”。因此，生地黄为臣药，与麦冬二药合用，金水相生，畅利三焦。
       
       赤芍药酸苦性平，有散邪行血之功，《别录》言：“通顺血脉，缓中，散恶血，逐贼血。”白芍药酸苦，性平，有敛阴益营之力，“收阴气而泄邪气”“敛津液而益荣”一泻一补，有相辅相成之效。白芍药敛阴、赤芍药凉血，合用敛阴凉血而不恋邪。桃仁味苦甘，性平，入心、肝、大肠经。具有破血行瘀，润燥滑肠的功效。《本草纲目》记载桃仁主血滞风痹，《用药心法》曰”“桃仁，苦以泄滞血，甘以生新血，故凝血须用。又去血中之热。”李杲用桃仁治疗“热入血室，腹中滞血，皮肤血热燥痒，皮肤凝聚之血。”紫菀虽苦辛而温，但柔润有余，非燥烈可比。专能开泄肺郁，宣通窒滞，兼疏肺家气血，达宣开肺气，输布津液之效，以助药力，引诸药直达病所。以上4药共为佐使。
       
       诸药合用，共奏清燥解毒、活血化瘀、输布津液之功效。
       4.2  作用机制探析增液布津汤的组成药物大多数具有调节免疫的作用。现代药理证明，麦冬含多种沿阶草甾体皂苷、β－谷甾醇、氨基酸、多量葡萄糖及其葡萄糖苷等。具多种药理作用。其中对免疫系统的调节主要体现在麦冬多糖及皂苷上。国内外大量的研究表明，多糖对体液免疫、细胞免疫功能的促进和诱生多种细胞因子，是多糖发挥药效作用的机制之一［1，2］。麦冬多糖能显著增加小鼠脾重量、增强小鼠碳粒廓清作用、刺激小鼠血清中溶血素的产生［3］，可显著对抗环磷酰胺引起的小鼠白细胞下降，并能抑制淋巴细胞粘附于细胞外基质，改善由淋巴细胞浸润所致肝功能损伤。同时短葶山麦冬皂苷 C能极显著的增加小鼠免疫器官胸腺、脾脏的重量，可显著增加小鼠的碳粒廓清作用［4］。黄芪能增强网状内皮系统的吞噬功能，使血白细胞及多核白细胞数量显著增加，使巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数显著上升，对体液免疫、细胞免疫均有促进作用。
       
       太子参含氨基酸、多糖、皂苷、黄酮、鞣质、香豆素、甾醇、三萜及多种微量元素等。太子参总皂苷对小鼠抗疲劳、耐缺氧、耐低温有明显的作用。太子参总皂苷能增加小鼠免疫器官的重量，对小鼠网状内皮系统(RES)吞噬功能有明显的激活作用，对小鼠免疫后血清中溶血素的生成有一定的促进趋势。太子参对淋巴细胞有明显的刺激作用。
        
       枸杞子有增强非特异性免疫作用，对白细胞介素Ⅱ也有双向调解作用。小鼠灌服枸杞子水提取物或肌注醇提取物和枸杞多糖，均有提高巨噬细胞的吞噬功能，增强血清溶菌酶的作用，提高血清中抗绵羊红细胞抗体的效价，还能增加鼠脾脏中抗绵羊红细胞的抗体形成细胞的数量。从枸杞子提取的枸杞多糖可见到对动物有放射增敏现象，可保护小鼠免受因放射损伤引起的免疫功能低下，对下降的白血球有提升效果。
       
       赤芍有抗血栓形成、抗血小板聚集、抗凝血、激活纤溶作用，与其清热凉血功效有关；其还有保肝、镇痛、镇静、解痉等作用，与其散瘀止痛功效有关。研究表明赤芍抑制血小板聚集是通过增加cAMP水平来实现的。当血小板内cAMP水平升高时，血小板的黏附、聚集、释放功能均会受到抑制。
        从白芍根部提取白芍总苷（TGP）已经作为慢作用抗风湿药广泛应用于临床，是一种无明显毒性的新型抗炎免疫调节剂，体内外试验表明TGP对免疫细胞的增殖或分泌功能具有调节作用。调节T细胞亚群的平衡，是TGP使失调的细胞或体液免疫恢复正常的主要机制之一［5］。TGP对腹腔巨噬细胞产生TNF具有浓度依赖性的双向调节作用，高浓度TGP可负调节巨噬细胞产生TNF；TGP促进Ts细胞的诱导，使Th/Ts细胞比值降低［6］。
       
       桃仁及其多种水提物具有良好的抗炎作用，从其水溶性组织分离出的蛋白质PRB抗酶活性研究证实，其抗炎机制是对炎症化学介质缓激肽的抑制；有研究表明［7］，桃仁水提物、苦杏仁苷、桃仁脂肪油对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集都有不同程度的抑制作用，作用强度以桃仁水提物最强；桃仁还有非常明显的抑制醋酸扭体反应的作用；桃仁对免疫功能也有良好的调节作用，能提高患者NK细胞活性及血清补体C3、C4水平，促进血中免疫复合物的清除。
        在总结前人以滋阴为主治疗SS基础之上，认为气虚在SS发病过程中发挥重要作用，燥毒是发病之标，气阴两虚为致病之本，提出气阴双补法的治疗大法。在临床研究中证实，增液布津汤能有效缓解患者在口干、口腔烧灼感、眼干、眼异物感、鼻干方面的主观症状，提高生活质量；与我们观察到患者舌质、舌面、舌苔、舌下唾液聚集的临床体征相吻合。在实验室指标方面，增液布津汤能有效增加患者的唾液流量、泪流量；并且能纠正改善Ｔ淋巴细胞亚群比值，说明中药不仅能缓解患者口、眼干症状，而且能够纠正免疫紊乱，且疗效优于西药组。
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