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       【摘要】 
       目的比较常见抗菌中药的凝集活性。方法选用盐-磷酸（PBS）、Tris-HCl、乙酸钠缓冲溶液提取20种常见抗菌中药的凝集素，测定各提取液对兔血红细胞的凝集作用。结果20种抗菌中药用不同pH的浸提液提取后表现不同的凝集活性，在3种不同pH的浸提取液中均具有较高凝集活性的有虎杖、山豆根、黄连、板蓝根。结论抗菌中药多数有较好的凝集活性，PBS对中药材中凝集素的提取具广谱性。
       【关键词】  抗菌中药； 凝集素； 红细胞凝集试验
       The Hemagglutination Activities of the Extractions from 20 Kinds of Antimicrobial Chinese Herbs
       ZHANG Chaoyan, LAN Minbo, DAI Yajuan
       1.Research Center of Analysis and Test, East China University of Science and Technology,Shanghai 200237, China; 2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
       Abstract：ObjectiveTo compare the hemagglutination activities of the extractions from antimicrobial Chinese herbs.MethodsThe hemagglutination activities of the extractions from PBS,Tris-HCl,NaAcetate buffer solutions of 20 kinds of antimicrobial Chinese herbs on rabbit erythrocyte were measured by Hemagglutination titers.ResultsThe hemagglutination activities of these herbs were various in the three different buffer solutions;Furthermore, Rhizoma Polygoni Cuspidati, Radix Puerariae, Rhizoma Coptidis and Radix Isatidis  had high hemagglutination activities in the three different buffer solutions.ConclusionMost of antimicrobial Chinese have good hemagglutination activities;PBS can be used widely for the hemagglutination activities of the extractions from antimicrobial Chinese herbs.
       Key words：Antimicrobial Chinese herbs;  Lectins;  Hemagglutination activity
        我国是水产养殖大国，但是水产病害一直是制约水产养殖发展的主要因素。为治疗和预防鱼虾贝类的疾病，人们广泛使用各种化学药物和抗生素。长期用药，不仅使病原菌的抗药性越来越明显，而且药物残留和环境污染日趋严重，生态养殖和科学防治成为水产养殖面临的迫切问题。在长期的养殖活动中，发现采用中药如黄连、大黄、板蓝根等可以防治一定的水产病害。这与中药能提高水产动物非特异性免疫能力，调整机体新陈代谢，提高抗应激能力等多种作用有关［1，2］。
        在水产动物中，分为无脊椎动物和脊椎动物。脊椎动物主要行使非特异性免疫与特异性免疫。属于无脊椎动物的甲壳动物和软体动物均缺乏免疫球蛋白，主要通过物理屏障、吞噬作用、溶菌作用和凝集作用等清除入侵的病原菌。凝集素(Lectin)能够与碳水化合物和糖蛋白结合, 从而使异源细胞或微生物发生凝集, 或使各种可溶性糖结合物发生沉淀, 被认为是机体自然防御机制中的免疫识别和监测分子。鱼虾贝类免疫系统不像高等动物那样完善, 凝集素等非特异性免疫因子在其防御病原微生物过程中发挥着重要的作用［3～6］。
        虽然目前关于中药提高免疫和抗菌用于水产病虫害防治的研究较多，但多数集中在粗提物、小分子和多糖等活性成分［7～11］，对于抗菌中药中的凝集素，如何通过外源途径提高水产动物的防病能力研究报道极少。鉴于此，本研究选用了3种浸提液提取20种中药的凝集素，测定这些常见抗菌药物的提取液对兔血红细胞凝集作用的强弱。旨在为研究水产养殖抗菌中药的抗菌和免疫物质基础提供研究思路和数据，为抗菌中药的筛选及水产病虫害的防治提供实验依据。
       1  材料与方法
       1.1  中药材20种中药从上海董涵春堂药店购买，均未炮制处理，切细或粉碎，过筛，备用。
       1.2  浸提缓冲液盐—磷酸缓冲液(PBS) pH7.2；0.05 mol/L Tris-HC1 1 mol/L NaC1缓冲溶液，pH8.0；0.05 mol/L NaAcetate(乙酸钠)(1 mol/L NaCl) 缓冲溶液，pH 5.0。
       1.3  2％红血球生理盐水悬液兔红血球取自上海第二军医大学所提供的家兔，取兔新鲜血液，加入装有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇数分钟或用玻璃棒搅拌，除去纤维蛋白原，用生理盐水冲洗，离心2～3次(3 000r/min，5 min)，至上清液不呈红色为止。然后根据红血球体积用生理盐水配成2％的混悬液。
       1.4  样品浸提液的制备将20种药材每份称重1 g，称取3份，分别加入10 ml的PBS缓冲液、Tris-HC1缓冲液、NaAcetate缓冲液浸泡过夜，然后将浸提液离心(10 000r/min，5 min) ，保存备用。
       1.5  凝集效价测定［12］取96孔V型凝集板，每孔加入25 μl PBS，然后在每排第一孔加样品粗提液25 μl，依次倍比稀释，每一样品作3排，最后分别加入兔红血球悬液25 μl，设PBS为空白对照。静置1 h后，用肉眼和显微镜观察其凝集效价。
       
       用同样方法分别做 Tris-HC1缓冲液、乙酸钠缓冲液样品的凝集效价。
       2  结果
       2.1  20种抗菌中药PBS提取液的凝集效价测定结果抗菌中药材中提取的凝集素生物活性的大小通常用凝集效价来表示，即能引起凝集现象凝集素的最高稀释倍数2n表示 (n为中药材待测样品所含凝集素的稀释倍数，稀释倍数越高其生物括性就越高)。各抗菌中药材的凝集素活性见表1。表1  20种抗菌中药PBS提取液的凝集效价（略）
        由表1可见，被测的20位味中药材分属l3科，其中17种有凝集活性，占到总数的85％。使兔红血球凝集的效价最高为256，最低为1。将抗菌中药材中提取的凝集素的凝集效价分列为四级(见表1)。一级效价大于128，计3种：虎杖、山豆根、板蓝根；二级效价为32～64，计6种：芦荟、鱼腥草、百合、党参、黄芪和黄连；三级效价为8～16，计7种：川芎、黄精、栀子、补骨脂、甘草、黄柏、北柴胡；四级效价小于8，计4种：大黄、黄芩、紫草、金银花。
       2.2  20种抗菌中药的不同pH值浸提液的凝集效价测定结果为了筛选这20种抗菌中药最佳的凝集效价，选用了3种不同pH值浸提液作比较。结果见表2。表2  20种抗菌中药的不同pH值浸提液的凝集效价（略）
        从表2可以看出，这20种抗菌中药用不同pH的浸提液提取后表现不同的凝集活性， 例如补骨脂在PBS和Tris-HC1缓冲液凝集活性（23）远低于在乙酸钠缓冲液凝集活性（26）；但山豆根在Tris-HC1缓冲液凝集活性最高（23）；北柴胡在乙酸钠缓冲液凝集活性最高（23）。这20种抗菌中药用PBS浸提，其中16种有较好的凝集活性，占到总数的80％，这表明PBS对中药材中凝集素的提取具有一定的广谱性。
       3  讨论
        经过本研究发现，20种抗菌中药在3种不同pH的浸提液中均具有较高凝集活性的有虎杖、山豆根、黄连、板蓝根。无论是在治疗和预防人患感冒疾病还是水生动物疾病的防治中，这4种中药都是抗菌疗效肯定深受群众欢迎的常用品种。胡兴昌等［13］研究表明板蓝根的明板蓝根凝集素的效价与其抑制流感病毒的作用成正相关。是否其他抗菌中药所含的凝集素也有同样的作用，其量效关系如何，在后续的研究工作中会在分离纯化抗菌中药所含的凝集素基础上，研究凝集素的效价与其抗菌作用的相关性，探究其与水生动物免疫的关系。
        凝集素对水产动物的影响及抗菌中药在水产疾病防治药物筛选上的有重要意义。近年来病害对水产养殖业造成的危害加剧，水产养殖动物生活在种群复杂的水域环境中，受致病菌侵染而致病的危险性始终存在。目前认为水产动物免疫系统在对致病菌进行防御因子包括凝集素、防御素、溶菌酶等。而凝集素作为无脊椎动物的甲壳动物和软体动物体内广泛分布的一种天然的非免疫起源的蛋白质或糖蛋白，具有凝集细胞、抑制肿瘤细胞增殖、激活淋巴细胞、抑制血小板凝集、毒性集等多种生物活性，在生物学、医学研究及病害防御中具有重要意义。然而，迄今为止，对于水产动物外源凝集素的作用相关基础研究极少。
        本研究中筛选的部分抗菌中药，长期作为水产动物疾病防治药物使用，疗效肯定。但对于其抗菌的物质基础和机理研究较少，因此对抗菌中药凝集素进行凝集活性检测及性质研究，以期对水产养殖的病害防治机制提出新的认识，同时也为进一步开发凝集素的新来源提供科学依据。
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