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       【摘要】 
       目的为探讨补骨脂汤对改善血管性痴呆大鼠的空间学习记忆的机理。方法用双侧结扎颈动脉反复灌注，用Morris试验测试大鼠的空间学习记忆，RT-PCR测定与学习记忆密切相关的NR2B、BDNF/TrkB基因表达产物。结果补骨脂汤高、低剂量组的逃避潜伏期都明显短于模型组（P<0.01），补骨脂汤高、低剂量，均可明显提高NR2B、BDNF/TrkBmRNA表达（P<0.05）。结论补骨脂汤能明显改善血管性痴呆大鼠的空间记忆，其可能的机制是通过提高NR2B、BDNF/TrkBmRNA表达水平而发挥作用的。
       【关键词】  补骨脂汤；血管性痴呆；NR2B； BDNF/TrkBmRNA
       Effect of Buguzhi Decoction on the Gene Expression of NR2B、BDNF/TrkB in Hippocampus of Vascular Dementia Rats
       ZHENG Lixiang, CUI Zhiyuan, GUO Huijun, YU Shiping
       (Jiangxi University of TCM, Nanchang,Jiangxi 330004, China)
       Abstract：ObjectiveTo elucidate the mechanism of BuGuZhi Decoction how to improve vascular dementia rats on spatial learning and memory.MethodsExperimental VD model rats were subjected to the bilateral common carotid arteries ligation and reperfusion, the performance of spatial learning and memory of  all rats were measured using the Morris Water Maze.We studied the level of NR2B、BDNF/TrkB mRNAs in the hippocampus of rats by RT-PCR technique. ResultsBuGuZhi Decoction could significantly shorten the escape latency time in place navigation test，increase the number of passing through primary flat place in spatial probe test（P<0.01）. The level of NR2B、BDNF/TrkB mRNAs in the BuGuZhi Decoction group were markedly higher than those of the model group and the sham operation group（P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionBuGuZhi Decoction can improve the spacious learning-memory.The mechanism may  enhance the expression level of NR2B、BDNF/TrkB mRNAs .
       Key words：BuGuzhi Decoction;  Vascular dementia;  NR2B;  BDNF/TrkB
        随着人类的寿命日趋延长,老年性痴呆的患病率也逐渐增加，该病严重影响老年人的生活质量，引起了医疗界的广泛关注。在我国常见的老年性痴呆主要是血管性痴呆(VaD)。血管性痴呆是由一系列脑血管因素导致脑组织损害所引起的痴呆的总称，为一种进行性疾病，预后不良,国内外学者一直进行研究以图改善病人症状，提高生活质量，延长寿命。西医治疗本病存在局限性，而中医治疗本病疗效显著，可以明显改善生活质量，因此，得到广泛认可。根据该病的成因和临床表现，中医辨证认为病位在于脑，涉及肝、肾、心、脾，病因病机为本虚标实。本虚即气虚、肾虚；标实为气滞、血瘀、浊毒、火盛。往往因虚致使痰瘀浊毒留于脑窍，形成巢囊，脑气与脏气不相接续而致病［1～3］。故本实验以此病因病机为依据，初步研究发现补骨脂汤能明显改善血管性痴呆大鼠空间的学习记忆，但其作用机理目前尚不清楚，故本实验将从空间学习记忆密切相关的的NMDAR2、BDNF/TrkB基因表达产物入手，进一步阐明作用途径，为其临床应用提供实验依据。
       1  材料与仪器
       1.1  动物实验动物选用SD大鼠60只(购于南昌大学医学院动物中心)，雌雄各半，体质量160～180g。
       1.2  中药由江西中医学院附属医院药房提供。
       1.3  仪器及试剂水迷宫实验装置，PCR扩增仪,核酸电泳槽，DPG-900型凝胶图像分析系统，净化台，DYY-5型电泳仪。Trizol及Taq酶均自美国Invitrogen公司，其他化学试剂都是国产试剂。
       2  方法
       2.1  分组把60只大白鼠随机分成5组，每组雌雄各半，分别为假手术组，模型组，中成药组，补骨脂汤低剂量组，补骨脂汤高剂量组。
       2.2  造模在造模前补骨脂汤高、低剂量组用补骨脂汤灌胃7 d，第8天对5组进行手术造模，用2﹪的戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，75﹪酒精消毒颈前皮肤，颈正中切口分离双侧颈总动脉穿线备用，用无创动脉夹夹闭一侧颈总动脉10min,去夹后立即关闭另一侧颈总动脉，每侧夹闭1次，每次10min，去动脉夹撤线缝合皮肤，在手术部位撒一层青霉素粉末。假手术组只进行颈总动脉的分离不夹闭血管，各组手术造模后待大鼠苏醒然后放回笼中保温饲养。
       2.3  给药方法
       术后第3天开始给药，中成药组剂量予银杏叶片7.2mg/(kg·d),补骨脂汤低剂量组剂量予9.82mg/(kg·d)，高剂量组剂量予19.64mg/(kg·d)，2次/d，连续25d。
       2.4  Morris实验
       将大鼠面向池壁置于象限1/2弧度处入水，经120s未找到站台的大鼠，将其引至站台停留10s,引导其学习记忆，各组大鼠每天训练2次，共训练6d，记录大鼠找到平台的确切时间。在整个实验中，实验者要与动物视线隔开，室内要保持安静及周围环境的相对稳定。
       2.5  半定量的RT-PCR 
       按照TRIZOL试剂说明书提取总RNA，在20μl反转录反应体积中进行反转录，合成cDNA。取上述逆转录产物PCR扩增NR2B、BDNF、TrkB。NR2B：Forward primer:5’GCTCAGCGACCTGTATGG3’，Reverse primer:5’AGGCGAGTTCTCCTTTGTT3’，产物长度331bp；BDNF：Forward primer:5’TTATTTCATACTTCGGTTGC3’， Reverse primer:5’ATGGGATTACACATTGGTCTC3’,产物长度547bp； TrkB：Forward Prime:5’GGCTTATGCTTGCTGGTC3’,Reverseprimer:5’CTGGGTCAATGCTGTTAGGT3’,产物长度148bp。25 μl PCR反应体系中进行PCR反应（NR2B mRNA、BDNF mRNA、TrkB mRNA:95℃ 5min, 94℃ 30s, 53℃ 20s,72℃ 30s,30个循环，72℃终延伸5min；GAP-43mRNA：95℃ 5min, 94℃ 30s, 55℃ 20s,72℃ 30s,30个循环，72℃终延伸5min ）。PCR产物用2﹪琼脂糖凝胶溴化乙锭电泳分离，用凝胶图形分析系统进行拍照，观察结果并测定灰度值，以扩增的目的条带和同时扩增的β–actin的灰度值比对各基因转录水平进行衡量。
       2.6  统计学处理数据采用±s表示，应用应用SPSS15．0统计软件，组间比较采用方差分析及q检验。
       3  结果
       3.1  补骨脂汤对血管性痴呆大鼠空间学习记忆的影响
       给药30 d后，进行Morris实验，结果见表1 ，从表1数据可以看出，各大鼠在游泳测试中，其逃避潜伏期都随游泳天数的增加逐渐下降，且前三天的的逃避潜伏期下降速度比较快，后三天的潜伏期逐渐稳定下来。而且，与模型组相比，补骨脂汤的高、低剂量组和银杏叶片组的逃避潜伏期都有明显的缩短（P﹤0.01），表明补骨脂汤和银杏叶片对血管性痴呆大鼠的空间记忆都有明显的改善作用。且补骨脂汤的高、低剂量组的逃避潜伏期比银杏叶片组有明显的缩短（P﹤0.01），表明补骨脂汤改善血管痴呆大鼠的空间记忆的作用要优于银杏叶片。表1  各大鼠在Morris水迷宫实验中的空间辨别记忆的逃避潜伏期（略）
       3.2  补骨脂汤对血管性痴呆海马内NR2B、BDNF/TrkB mRNA表达的影响
       用RT-PCR的方法对NR2B、BDNF/TrkB mRNA表达水平进行分析，发现:与模型组比较,补骨脂汤无论是高剂量，还是低剂量，均可明显提高NR2B、BDNF/TrkB mRNA表达（P<0.05）,而银杏片组只提高了BDNF/TrkB mRNA表达水平(P<0.05)；尽管补骨脂汤组与银杏片组无明显差异（P>0.05），但补骨脂汤促NR2B、BDNF/TrkBmRNA表达水平要高于银杏片(表2)。表2  补骨脂汤对血管性痴呆海马内NR2B、BDNF/TrkBmRNA表达的影响（略）
       4  讨论
        中医认为，VaD的发病病位在脑，属本虚标实之证，本虚即气虚、肾虚；标实是指痰浊、瘀血、浊毒。本虚标实相互夹杂、影响、转化，复加饮食、情志、劳逸等因素，而致脏腑功能失调，气滞血瘀，浊毒内生，脑气脏气不相顺接 ，脑髓失养而成本病［4］。
        根据该疾病的病机，本实验室选用补骨脂汤治疗血管性痴呆大鼠，发现：补骨脂汤的高、低剂量组的逃避潜伏期都有明显的短于模型组，说明补骨脂汤能明显改善血管性痴呆大鼠的空间记忆（P<0.01）。这可能是补骨脂汤中的人参大补元气，使气旺精足，安神益智；补骨脂、益智仁、苁蓉、熟地具有补肾填精功效；远志能祛痰开窍；大枣、当归具有益气作用；丹参有活血行气祛瘀通络的作用。诸药合用，使其具有补肾精、益气血、活血化痰的作用，从而改善了大鼠的空间学习记忆［2，3］。
        为进一步阐明该方的作用机理，本实验对海马内影响空间学习记忆的NR2B、BDNF/TrkB基因表达产物进行分析，发现：补骨脂汤无论是高剂量，还是低剂量，均可明显提高NR2B、BDNF/TrkB mRNA表达，提示：补骨脂汤改善痴呆大鼠的空间学习记忆可能与NR2B、BDNF/TrkB基因表达产物有关。因为在哺乳动物中枢神经系统中，由 NMDA受体介道的兴奋性神经传导在生理、病理过程中发挥重要作用，也是人类治疗神经疾病希望的靶点，通过NMDA受体的激活作用调节基因表达，会影响神经发育、突触可塑性及学习记忆，含NR2B和NR2A的NMDA受体相互藕联产生明确的细胞内的信号转导，导致了的BDNF的表达和细胞外信号调节激酶1/2激活［5～7］。但方中的哪些成分是影响NR2B、BDNF/TrkB mRNA表达，从而改善血管性痴呆大鼠空间学习记忆，目前尚不清楚，将是今后研究的重点，也是中药现代化研究的重要方面。
       【参考文献】
         　　［1］姚龙华.血管性痴呆辨治心法［J］.四川中医,2008，26（3）：56.
       
       ［2］郑里翔,汪 敏,辛增平.补骨脂汤对实验性血管性痴呆大鼠学习记忆行为学的影响［J］.江西中医学院学报，2007 ，2：67.
       
       ［3］郑里翔，汪 敏，辛增平.补骨脂汤对血管性痴呆大鼠海马内C-FOS基因表达及学习记忆的影响［J］.中医药学刊,2006，24（5）：278.
       
       ［4］闫敬来,陈燕清.老年痴呆病机的中医学认识概述［J］.中华中医药杂志,2008，23（7）：168.
       
       ［5］Jennifer J. Brightwell, Clayton A. Smith,et al.Long-term memory for place learning is facilitated by expression of cAMP response element-binding protein in the dorsal hippocampus［J］. Learn. Mem,2007 14: 195.
       
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       ［7］Mariana Alonso, Jorge H. Medina, et al.ERK1/2 Activation Is Necessary for BDNF to Increase Dendritic Spine Density in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons［J］.Learn. Mem, 2004 11: 172.