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       【摘要】 
       目的制备更年期抑郁症大鼠模型，观察补益肝肾中药对大鼠模型行为学测试结果的影响，了解补益肝肾中药防治更年期抑郁症的效果。方法采用雌性SD大鼠，在卵巢切除术的基础上，联合孤养和21 d慢性不可预见性的温和刺激（CUMS）制备更年期抑郁症大鼠模型。以Open-Field测试大鼠的直立活动和水平活动得分；以1 h内大鼠摄入饮用水及蔗糖水量计算糖水消耗百分比；以Morris水迷宫测试大鼠的学习记忆力。结果行为学测试方面：中药组大鼠水平活动得分和直立活动得分均有所上升；糖水消耗百分比升高；学习记忆力有所增强。结论补益肝肾中药具有防治更年期抑郁症的效果。
       【关键词】  慢性不可预见性的温和刺激 ； 更年期抑郁症； 行为学测试
       更年期抑郁症是诸多抑郁症中的一种类型，是特指初次发病于更年期（也称为围绝经期，是指从卵巢功能紊乱到绝经后1年），以焦虑不安和情绪低落为主要症状的疾病，属于情感性精神障碍［1］，同时伴有思维迟缓、意志活动减退等症状，即存在认知功能障碍。据调查，更年期与抑郁症的高发病率有密切关系。［2］现代医学对更年期抑郁症的治疗包括激素替代疗法［3］以及采用激素替代和抗抑郁药联合［4］等方案。使用以上这些药物，在短期内症状缓解明显，但其产生的副作用是一个不容忽视的事实，如雌激素替代疗法造成的子宫内膜癌、乳腺癌等［5］以及抗抑郁药物引起单胺类递质合成障碍，抑制性功能的副作用等。中药对更年期抑郁症有一定的治疗效果。
        补益肝肾中药更年方是临床上用于治疗妇女更年期抑郁症的基础方，该方的基本组成为知母、黄柏、巴戟天、仙茅、仙灵脾等，临床上在辨证论治的基础上使用此方加减治疗妇女更年期抑郁症，具有较好的效果。然而对此方的实验研究却未见报道。因此，本文采用雌性SD大鼠，在卵巢切除术的基础上，联合孤养和21 d CUMS制备更年期抑郁症大鼠模型，观察补益肝肾中药对更年期抑郁症大鼠模型行为学的影响，了解该方的防治效果，为下一步探讨补益肝肾中药防治更年期抑郁症的作用机制提供实验基础。
       1  材料与仪器
       1.1  动物SD大鼠27只，雌性，2～3月龄，由上海中医药大学动物实验中心提供，合格证编号：SCXK（沪）2003-0002。适应性喂养1周后，采用随机数字表将大鼠分为去势组、模型组和中药组，每组9只。去势组4只/笼或5只/笼，正常饮食进水，行卵巢切除术，不给予任何刺激。模型组1只/笼，进行卵巢切除术，术后正常饲养3周后接受21 d CUMS。中药组1只/笼，进行卵巢切除术，术后正常饲养3周后接受21 d CUMS，每次应激结束后，撤除一部分饲料，放置药物，任其自由取食，连续21 d。
       1.2  中药处方及制备补益肝肾中药由知母、黄柏、巴戟天、仙茅、仙灵脾、女贞子、旱莲草、远志、枣仁、淮小麦、红枣、炙甘草、当归组成，实际上包含二仙汤、二至丸等经典方。大鼠每日用量为人的千克体质量20倍量。煎煮的滤液含生药3.722 g/ml，放置于4℃冰箱中保存备用。
       1.3  仪器敞箱（自制），Morris 水迷宫视频跟踪分析系统（成都泰萌科技有限公司）。
       2  方法
       2.1  动物模型制备
       2.1.1  卵巢切除术大鼠经1%戊巴比妥钠（40 mg／kg）腹腔注射麻醉，行双侧卵巢切除术。手术后使其休息3周。
       2.1.2  慢性不可预见性的温和刺激按Willner 等［6］稍改进，将动物每周随机给予夹尾、禁水、禁食、昼夜颠倒、水平振荡、电击、4℃冰水游泳等方法刺激，每日采取1种方法进行刺激，连续21 d。
       2.2  大鼠体质量称量 于适应1 d、应激第1天、应激第7天、第14天及第21天，进行称量。
       2.3  大鼠行为学测试
       2.3.1  Open-Field测试
       于适应1 d、应激第1天、应激1周及应激3周时，用自制的敞箱进行测试。以动物穿越方格数作为水平活动得分（crossing），动物穿越1格为1次，如动物沿线行走，每10 cm为1次。以直立次数为垂直活动得分（rearing），以两前肢离地为1次。每只动物测定1次，3 min/次。保持环境安静，每次测试前保持敞箱内干净。
       2.3.2  蔗糖水摄入量
       于应激1 d、1周及3周时（即应激结束后1 d）进行测试。各组动物同时放入饮用水和1%蔗糖水，1 h后称量各只大鼠的饮用水量及蔗糖水消耗量，计算糖水消耗百分比。
       2.3.3  学习记忆力测试
       应激结束后1～5 d采用Morris水迷宫进行测试。水迷宫测试时，2次/d，上午9:00～11:00进行。将测试时间设置为70 s，操作者随机将大鼠从非平台所在象限的其他两个入水点将大鼠面向池壁放入水中, 观察并实时记录大鼠在70 s内找到并爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期（escape latency），大鼠如果在70 s内仍未找到平台，则将其牵引至平台停留10 s, 引导其学习记忆，潜伏期记为70 s。逃避潜伏期时间越短学习记忆力越好。同时根据大鼠在水中搜索平台的游泳轨迹确定其每次的搜索策略。寻找平台的策略分为边缘型、随机型、趋向型和直线型。直线型以大鼠入水后的第1个点和平台之间的连线为中轴，若大鼠的所有运动轨迹点与中轴的距离均不超过一定范围，该运动策略即为直线型。趋向型与直线型相似，只是运动轨迹与中轴的距离取得更大。边缘型是以大鼠运动区域的中心为圆心，取一定半径作一个圆，如果大鼠的大部分运动轨迹点均在圆外，则认为此运动轨迹为边缘型。如果大鼠的运动策略不是以上3种则认为是随机型。
       2.4  数据处理
       采用完全随机设计方法，以±s表示。计量指标满足条件用方差分析进行检验，用统计软件SPSS12.0进行检验，以P﹤0.05作为显著性差异的标准。
       3  结果
       3.1  实验动物的一般情况手术后1周内大鼠活动轻微障碍，1周后动物反应及活动可，精神稍差。模型组大鼠在应激3周后呆滞少动，大多蜷缩在一角或钻入垫料中；此外去势组和模型组毛发较粗糙，并易出现激惹现象。中药组大鼠毛发光滑，精神反应及行为较灵敏。所有大鼠均完成预计实验。
       3.2  大鼠体质量在适应期间，各组大鼠的体质量无显著性差异；施行卵巢切除术后，大鼠体质量增长均较快。自应激开始后，各组大鼠体质量增长速度不一致，去势组大鼠仍呈现较快增长；模型组大鼠增长稍缓慢；中药组体质量增长较平稳，至应激1，2，3周时，与正常组增长趋势相近，与去势组和模型组相比，均具有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。表1  补益肝肾中药对更年期抑郁症大鼠模型体质量的影响（略）
       3.3  补益肝肾中药对大鼠模型Open-Field测试结果的影响测试结果显示：在第1天应激时，各组大鼠敞箱试验结果之间无显著差异；随着时间的延长，各组大鼠直立活动得分和水平活动得分均有所减少。应激1周和应激3周时，与去势组大鼠相比，模型组大鼠和中药组大鼠各活动得分均减少；与模型组大鼠相比，中药组大鼠无论是直立活动得分和水平活动得分基本上均稍高于模型组大鼠。结果见表2。表2  补益肝肾中药对大鼠模型Open-Field测试结果的影响（略）
       3.4  补益肝肾中药对大鼠模型蔗糖水消耗的影响 从表中可以看出，应激1 d时，各组大鼠糖水消耗百分比都比较接近；应激1周时，模型组大鼠及中药组大鼠糖水消耗百分比都较前减少，而去势组大鼠糖水消耗百分比较前增加；至应激3周，去势组大鼠糖水消耗百分比继续增加，模型组大鼠糖水消耗百分比继续下降，而中药组大鼠糖水消耗百分比则有所上升，并高于模型组大鼠。结果见表3。表3  补益肝肾中药对更年期抑郁症大鼠模型糖水消耗百分比的影响（略）
       3.5  补益肝肾中药对大鼠模型学习记忆的影响
       3.5.1  补益肝肾中药对大鼠模型逃避潜伏期的影响第1天测试，中药组大鼠平均逃避潜伏期短于去势组和模型组。各组大鼠第2，第3，第4天测试，平均逃避潜伏期迅速下降，至第5天时，平均逃避潜伏期趋于稳定。在第1，2天和第3天，模型组大鼠的平均逃避潜伏期基本上均长于去势组；与模型组大鼠相比，中药组大鼠于所有测试时间段的平均逃避潜伏期均短于模型组大鼠。结果见表4。表4  补益肝肾中药对更年期抑郁症大鼠模型逃避潜伏期的影响（略）
       3.5.2  各组大鼠搜索平台策略比较大鼠在进行定位航行实验学习记忆试验时具有不同的搜索策略。边缘型大鼠沿水池周边企图搜索到水下平台，可以说根本就没有学会找到平台的要领。随机型大鼠在搜索目标时，漫无目的地撞大运，靠运气找到水下平台，它们可能知道平台在中间某个地方，但不清楚方位。趋向型大鼠可能知道水下平台的方位，在一次找不到后会试图再次尝试到目的地寻找。直线型大鼠知道水下平台的方位，从入水点直接向平台方位直线寻找，表明其记忆能力最强。结果见图1。
        从表中可以看出，去势组大鼠搜索策略多为趋向型；模型组大鼠的搜索策略多为边缘型和随机型；中药组大鼠大多可从入水点直接向平台方位直线寻找，故其搜索策略多为直线型。见表5。表5  补益肝肾中药对大鼠模型搜索平台策略的影响（略）
       4  讨论
        抑郁症是精神科领域的常见疾病，随着现代社会竞争压力的进一步加大，遭受抑郁症困扰的人数与日俱增。据世界卫生组织统计，全球抑郁症的发病率约为 11%，已成为世界第四大疾病，预计到 2020 年可能将成为仅次于心血管疾病的人类第二大疾患。男女均可发病，但以女性为多。据调查，更年期与抑郁症的高发病率有密切关系。［2］因而研究和治疗更年期抑郁症已成为国际医学界关注的热点。
        许多疾病的深入认识都曾得益于成功的动物模型，但更年期抑郁症的动物模型报道并不多见。对于实验性抑郁症的动物模型，目前已建立了几类较好的动物模型，其中Willner 等［6］建立的CUMS是目前应用较多的模型之一。经典的更年期动物模型多采用雌性大鼠卵巢摘除。这些动物模型均仅反映了本病的一个方面，未能全面反映更年期抑郁症的生殖内分泌激素、神经递质的改变，而更年期抑郁症的发病机制是以卵巢功能减退与神经递质的改变为主，故本实验采用复合处理制备大鼠的更年期抑郁症模型，以卵巢切除术为内在因素，以CUMS和孤养状态模拟人类更年期抑郁症的外在因素，制备大鼠更年期抑郁症动物模型。根据Willner理论，以快感缺乏作为抑郁症模型成功的指标。本文观察到：与去势组相比，模型组大鼠在规定时间内的水平活动得分和垂直活动得分均减少；蔗糖水消耗的百分比降低，即活动度降低，兴趣度下降，对奖赏的反应性下降。上述结果提示：给予CUMS后，动物表现出的抑郁状态、兴趣丧失、快感缺乏，与抑郁症的临床表现［7］有一定程度的相似性。因而认为更年期抑郁症大鼠模型制备成功。
        中医学认为更年期抑郁症的主要病理特点是肾虚肝郁，病变可涉及心、肝、脾各脏，病久可兼血瘀征象，故临证时宜谨守病机，审证度微，分清主次，标本兼顾。治疗原则以补肾为主，调肝为标，化瘀相辅，佐以养心安神。肾虚是该症发病与转归的关键，补肾应贯穿始终。［8］《素问·上古天真论》云，“任脉虚，太冲脉衰，天癸竭”“五八肾气衰，发堕齿槁”。更年期的妇女肾精渐亏，髓海渐空； 根据五行生克理论表现肝肾同源，肾水不足，水不涵木，则肝气郁结，水火不济，致心火上炎，耗伤心血，而心主神明，肝主疏泄与情志密切相关。因此，“肾精亏损，肝肾不足”是更年期抑郁症的病因病机不容忽视的重要因素，对更年期抑郁症应多施以补益肝肾的治疗方法，调整机体内环境的阴阳平衡，以达到整体调整治疗的目的。本研究观察到补益肝肾中药能增加大鼠Open-Field测试中的水平活动及直立活动得分，提高糖水消耗百分比及缩短逃避潜伏期，显示该方具有增加大鼠活动度，提高大鼠对周围环境的兴趣及增强学习记忆力的作用，表明该方具有改善更年期抑郁症的效果。
       
       该方中的二仙汤是张伯讷教授在临床上反复筛选验证而最终研制出的方剂，该方载入多部中医方剂学著作，并得到了国内外中医界的公认。二仙汤具有温肾阳、益肾阴、泻肾火、调冲任的作用。方中仙茅、仙灵脾、巴戟天温补肾阳；黄柏、知母泻火益肾；当归则温润而具补血和血之功。方中辛温与苦寒共用，壮阳与滋阴并举，温补与寒泻同施，使阴得阳助而泉源不竭，阳得阴助而生化无穷，终达阴阳调和之效。马学玉［9］用二仙汤治疗更年期抑郁症，有效率达到75%。仙茅、仙灵脾是二仙汤中的重要组成部分，二者均归肾经，功效也主要以调节肾脏功能为主。
        因此，本研究结果为从肾论治更年期抑郁症提供了实验支持，同时也提示了更年期抑郁症病位在肾。下一步我们将探讨补益肝肾中药防治更年期抑郁症的作用机制。
       【参考文献】
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       ［9］马学玉.二仙汤治疗更年期抑郁症16例［J］.陕西中医,2002,23(5):438.