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       【摘要】 
       目的探讨中药草苁蓉提取物对AD模型大鼠学习记忆能力及神经元凋亡的影响。方法将60只健康SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和中药高、中、低剂量组。采用Aβ140建立AD模型，中药组予以草苁蓉提取物按高、中、低3种不同剂量灌胃治疗，治疗结束后测定其学习记忆能力和神经元凋亡百分比。结果中药组大鼠学习记忆能力高于模型组（P<0.01），而神经元凋亡百分比低于模型组（P<0.01）。结论中药草苁蓉提取物可有效改善AD大鼠学习记忆障碍，减少胆碱能神经元凋亡，从而起到治疗作用。
       【关键词】  阿尔茨海默病； 学习记忆能力； 神经元凋亡； 草苁蓉
       The Influence of Boschniakia rossica Extract on Learning and Memory Capability and Neuronal Apoptosis in AD Model Rats
       ZHOU Lisha，ZHU Shuxiu，WANG Lushan
       1.Medical School of Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei;2.Postgraduate of 2006，Hubei College of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430065，China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of Boschniakia rossica extract on learning， memory and neuronal apoptosis in AD model rats. Methods60 healthy SD rats were randomly divided into normal group， sham group， the model group and the group of traditional Chinese medicine with highdose， mediumdose and lowdose. To establish the AD model by Aβ140， give the traditional Chinese medicine groups were administered three different treatment doses of Boschniakia rossica extract:high， medium and low dose. After the treatment, rats learning，memory capability and the percentage of neuronal apoptosis were tested. ResultsThe learning and memory capability in the group of traditional Chinese medicine rats is better than in the model group (P<0.01)， while the hippocampus and cortex parts neuronal apoptosis percentage is lower than the model group (P<0.01). ConclusionThe herb Boschniakia rossica extract to AD rats can effectively improve learning and memory obstacle，inhibit the cholinergic neuronal apoptosis.
       Key words： Alzheimer"s disease;  Learning and memory capability;  Neuronal apoptosis;  Boschniakia rossica
       
       阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD）是一种以进行性智能衰退为主要临床特征的多因性疾病，目前认为β淀粉样蛋白（amyloidbeta protein，Aβ）神经毒性作用所致中枢上行胆碱能系统损伤是AD认知功能障碍的重要决定因素。越来越多的证据显示神经细胞的凋亡参与AD的发病，而且APP突变对细胞凋亡的引发起重要作用，其中聚集性Aβ对神经细胞的毒性更大，并且其他一些致病因素都是通过Aβ对神经元的直接作用而引起细胞损伤的［1］。为此，本实验采用流式细胞仪观察中药草苁蓉对AD大鼠的学习记忆能力及神经元凋亡的影响，以证明草苁蓉在AD治疗中的价值，为其保护和研究开发提供实验依据。
       1  材料与仪器
       1.1  动物取健康SD大鼠60只，体质量200～250 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
       1.2  仪器与试剂
       WDTⅡ微电极推进器脑立体定位仪（国营西北光化学仪器厂）、Morris水迷宫自动控制仪装置和XCS2大鼠自动穿梭控制仪(中国医学科学院药物研究所)、岛津 UV265型紫外可见光比色计、LG3A型高速冷冻离心机(北京医用离心机厂)、DK8AX型恒温水浴箱(上海一恒仪器)、G6805Ⅱ型电针仪（上海产）。Aβ140（美国Biosource公司）；标准品氯化乙酰胆碱为美国ACROS公司生产；毒扁豆碱(ALEXIS公司)；氯化羟胺、盐酸羟胺、三氯乙酸、三氯化铁等均为国产分析纯。1∶6草苁蓉提取物（江汉大学医学院提供）。Aβ孵育：Aβ140加入0.1%三氟乙酸后放入37℃水浴恒温箱孵育48 h，使其成为凝聚状态备用。
       2  方法
       2.1  分组与治疗正常组大鼠10只，不进行任何处理及治疗。假手术组，中药高剂量组、中药中剂量组和中药低剂量组各10只。假手术组注射等量生理盐水，手术方法同模型组。将造模成功的动物随机分为模型组，中药组。模型组不进行任何治疗。中药组分为低剂量组、中剂量组和高剂量组，分别给予中药草苁蓉提取物1 ml（折合生药0.03 g/ml），2，4 ml灌胃，1次/d，每6 d为1个疗程，每疗程后休息1 d，连续治疗4个疗程。
       2.2  动物模型的制作各组大鼠在10%水合氯醛380 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定向仪。脑立体定位仪固定平颅头位切开皮肤及皮下组织，用棉签蘸取少量双氧水轻拭颅骨表面，清除泡沫能清晰显现前囟。参照大鼠脑立体定位图谱［2］，以前囟为原点，向后1.4 mm，旁开3.0mm为穿刺点转穿颅，自脑表面进针7.0 mm分别至双侧Meynert基底核，用微量注射器将聚集状态的Aβ140各1 μl（5 μg）在2 min内缓慢注入，留针10 min，以使Aβ140充分浸润局部组织，注射完毕后将微量注射器在7 min内缓慢抽出。假手术组注射等量的生理盐水。所有操作均在无菌条件下进行，术后每只大鼠腹腔注射青霉素1万U，缝合切口，常规饲养。
       2.3  指标观察及检测治疗结束后检测大鼠学习记忆能力及神经元凋亡百分比。
       2.3.1  学习记忆能力观察治疗后进行Morris水迷宫训练，首先进行定位航行试验，历时3天，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间，即逃避潜伏期。如果大鼠在120 s内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期为120 s。然后撤除平台进行水迷宫测试，以检测其学习记忆能力，任选一个入水点将大鼠放入水池中，考察大鼠对原平台的记忆，记录其穿过原平台所在位置的次数及在原平台象限的游泳时间以计算其游泳时间百分比。训练及测试期间水温在（26±1）℃，迷宫外参照物保持不变。数据采集和处理由Morris水迷宫图象自动监视处理系统完成。将各组测试成绩进行比较。
       2.3.2  海马及皮质部位神经元凋亡百分比的测定采用PI单染法测定。大鼠处死后迅速在冰台上分别取海马及皮质部位脑组织。将脑组织剪为细小部分（尽量避免破坏细胞结构），1 000 r/min离心5 min，弃去培养液，用3 ml PBS洗涤1次，离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃下避光放置12 h。然后离心弃去固定液，加入3 ml PBS重悬5 min。再用400目的筛网过滤1次，1 000 r/min离心5 min，弃去PBS。加入1 ml PI染液染色，4℃避光30 min。流式细胞仪检测其凋亡百分比。
       2.4  统计学处理实验数据用 SPSS 13.0软件进行统计学处理。数据以±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)及q检验。
       3  结果
       3.1  各组水迷宫测验成绩的比较结果
       见表1。表1  各组水迷宫测验成绩的比较(略)
       
        从表1可以看出，模型组和中药各组水迷宫测试成绩均低于正常组（P<0.01）；中药组低于正常组（P<0.01），但与模型组相比有所提高（P<0.01）；中药各组间也有差别（P<0.05或P<0.01），高剂量组优于中剂量组，中剂量组优于低剂量组。综合说明草苁蓉提取物能明显改善AD大鼠的学习记忆障碍。
       3.2  各组大鼠海马及皮质部位神经元凋亡百分比的比较结果
       见表2。表2  各组大鼠海马及皮质部位神经元凋亡百分比的比较(略)
        从表2可以看出，模型组海马、皮质部位神经元凋亡比例高于正常组（P<0.01）；中药组凋亡百分比高于正常组（P<0.01），但与模型组相比有显著降低（P<0.01）。说明草苁蓉可有效抑制Aβ脑内注射对神经细胞的毒性，降低神经元凋亡比例。
       4  讨论
        草苁蓉(Boschniakia rossica Fedtsch et Flerov)为列当科草本植物，俗称不老草，具有滋补强身、益寿延年之功及补肾壮阳、润肠止血之效。近年来文献报道，草苁蓉具有抗炎、抗缺氧、抗疲劳、促进记忆及增强免疫功能的作用［3～5］。朴龙等［6］通过实验发现草苁蓉提取物可提高D半乳糖所致衰老大鼠脑组织SOD活性，降低MDA含量，抑制MAO活性，电子显微镜观察到草苁蓉提取物可以减轻D半乳糖导致的线粒体等超微结构的改变，证实草苁蓉提取物对D半乳糖致衰老大鼠的脑组织自由基代谢具有抑制作用。
       
       老年人在增龄的过程中，人体的防御体系功能减弱，脑内自由基的清除能力降低。因此，在脑老化过程中，神经元细胞膜上不饱和脂肪酸被氧化而产生大量自由基，包括超氧化物阴离子自由基、过氧化氢、脂质过氧化物和自由羰基等含量增加［7］。这些自由基能损伤细胞膜、细胞器，诱导神经元凋亡，导致其功能严重破坏，从而促使AD的形成。氧自由基能促进Aβ的毒性和聚集，使其在脑内过度活跃，导致神经元退行性变而发生AD［8］，而Aβ也使自由基生成增多。
        本实验采用草苁蓉提取物灌胃治疗，观察其对AD大鼠学习记忆能力及神经元凋亡的影响。实验结果证明，草苁蓉治疗能显著降低AD大鼠脑内神经元凋亡百分比，提高学习记忆能力，起到了很好的抗衰老和促智作用。其作用机制有可能是通过清除Aβ1～40脑内注射所致自由基而发挥治疗作用的，其具体有效成分和作用机理有待进一步研究探讨。还可从实验看到，草苁蓉的治疗效果与其剂量有一定关系，剂量越高，治疗效果越好，但剂量与疗效之间是否存在线性关系，以及最佳剂量的选择有待进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］Smale G，Nichols NR，Brady DR. Evidence for apoptotic cell death in Alzheimer′s disease［J］. Exp Neurol，1995，133(3):225.
       
       ［2］包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱，第1版［M］.北京:人民卫生出版社，1994.
       
       ［3］尹宗柱，金海玲，李天洙，等.草苁蓉甲醇提取物对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝脏癌前病变的抑制作用［J］.中国中药杂志，1998，23(7):424.
       
       ［4］沈明花，尹宗柱.草苁蓉提取物对二乙基亚硝胺诱发的肝脏癌前病变大鼠抗氧化活力的影响［J］.中国中药杂志，1999，24(12):746.
       
       ［5］Yin ZZ，Jin HL，Shen MH，et al.Inhibitory effect of BR on DENinduced precancerous hepatic foci and antioxidative activities in rats［J］. Chin J Cancer Res， 1999，11(3): 169.
       
       ［6］朴龙，张学武，金香子，等. 草苁蓉提取物对衰老大鼠脑组织自由基的影响［J］.中西医结合学报，2003，1(2):125.
       
       ［7］SmithM A， PerryG，RicheyPL，etal.Oxidative damage in Alzheimer′s disease［J］. Nature， 1996， 382(6587): 120.
       
       ［8］李求兵，梅 荣.老年痴呆症的中西医诊断与治疗［M］.北京:中国医药科技出版社，1999: 167.