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       【摘要】 
       目的探讨中药复方达肝清对苯巴比妥钠诱导的小鼠肝细胞异常凋亡的影响，进一步揭示其抗肝损伤的作用机理。方法采用撤除苯巴比妥钠（PB）诱导 小鼠肝细胞凋亡的模型；通过流式细胞检测技术，TUNEL原位检测法，HE常规染色等方法，以肝细胞凋亡率、肝组织形态、原位细胞TUNEL反应、肝/体重比为指标，观察不同剂量达肝清对PB诱导肝细胞凋亡的影响。结果流式细胞仪分析表明，达肝清高、中剂量组肝细胞凋亡率明显低于凋亡对照组；达肝清高剂量组肝/体重比回落明显低于凋亡对照组；组织学染色及TUNEL反应，凋亡对照组可见凋亡小体，凋亡现象明显，凋亡细胞明显多于达肝清高、中剂量组。结论达肝清能明显抑制苯巴比妥钠诱导的肝细胞凋亡，进一步提示抑制肝细胞异常凋亡可能为其抗肝损伤的机理之一。
       【关键词】  达肝清；肝细胞凋亡；流式细胞术；原位末端缺口标记
       Effects of Chinese Herb Compound Daganqing on Apoptosis of Liver Cells in Mice
       HAO Erwei, DENG Jiagang, YAN Li
       1.Shandong Traditional Chinese Medical University, Jinan, 250355, China； 2.Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning, 530001, China
       
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of Chinese herb compound Daganqing on apoptosis caused by phenobarbital withdrawal of liver cells in mice, and to research the mechanism of its preventing acute liver injury. MethodsThe apoptosis model of liver cells in mice caused by phenobarbital withdrawal was used, FCM, TUNEL, and HE routine dye, were performed to check the changes in apoptotic cells. The rate of hepatocyte apoptosis, the hepatic histopathologic changes, tunnel change and liver body weight ratio were observed to study the effects of Daganqing in different dosages on apoptosis caused by phenobarbital withdrawal of liver cells. ResultsFlow cytometry analysis revealed that the apoptotic rate of liver cells and liver body weight ratio of Daganqing high and middle dose groups were obviously lower than positive group. By the analysis of TUNEL, and HE routine dye, apoptotic bodies and cell apoptosis were more conspicuous, and the number of apoptotic cell was more in positive group than other groups. ConclusionChinese herb compound Daganqing in the dosages of 34 g/kg，17 g/kg can obviously inhibit the liver cell apoptosis caused by phenobarbital withdrawal, and further reveal that inhibiting the liver cell apoptosis maybe one of the mechanisms of Daganqing preventing acute liver injury.
       Key words：Chinese herb compound Daganqing；Apoptosis of liver cells；  FCM；  TUNEL
       
       达肝清是由三姐妹、黄根等药物组成的中药复方，具有清热解毒、益气健脾、利湿化瘀等功效，临床上主要用于治疗急、慢性病毒性肝炎，疗效显著。研究已表明达肝清具有保肝降酶,抗乙肝病毒等作用［1］,对急、慢性肝损伤具有明显的保护作用［2］,同时对2215细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）有抑制作用［3］。本实验采用撤除苯巴比妥钠诱导肝细胞凋亡模型，观察达肝清对肝细胞异常凋亡的影响，以进一步揭示其治疗病毒性肝炎的作用机理。
       1  材料
       1.1 动物
        
       KM小鼠，SPF级，体质量（20±2.0）g,雌雄各半，广西壮族自治区药品检验所提供，许可证号：SCXK桂2003-0003。
       1.2 药液制备
       达肝清由三姐妹、黄根等药物组成（饮片由广西中医学院药学院蔡毅教授鉴定），经水提醇沉，滤液浓缩成浸膏，低温贮藏，用时用水稀释。
       1.3 试剂
       注射用苯巴比妥钠（上海新亚药业公司），细胞凋亡PI 荧光检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），RNase A（美国Sigma公司）, TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（德国Roche Applied Science公司），其余试剂均为国产分析纯。
       1.4 仪器
       显微镜（德国Leica公司），TGL-16M低温超速离心机（湖南塞特湘仪有限公司），EL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），HH-8数显恒温水浴锅(国华电器有限公司),EPICSXL型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。
       2  方法
       2.1  动物分组及处理
       小鼠60只，雌雄各半，共分为6组，每组10只，分别为空白对照组,非凋亡对照组，凋亡对照组，达肝清高剂量组(34 g/kg)，达肝清中剂量组(17 g/kg)，达肝清低剂量组(8.5 g/kg)。空白对照组ip无菌生理盐水，0.15 ml/10 g，1次/d，连续7 d；非凋亡对照组ip 0.5% PB，0.8 mg/10 g，0.15 ml/10 g，1次/d，连续7 d；凋亡对照组ip 0.5% PB,0.8 mg/10 g, 0.15 ml/10 g，1次/d，连续6 d。其余各药物组，首先ip 0.5% PB，0.8 mg/10 g，0.15 ml/10 g，1次/d，连续6 d。从撤除PB开始灌胃给药，0.2 ml/10 g，1次/6 h，至停PB后36 h。将所有小鼠脱颈处死，取肝组织。
       2.2 流式细胞仪分析
       取小鼠肝组织，分离肝细胞，用PBS 洗涤细胞1次（离心2 000 r/min，5 min）收集并调整细胞浓度为1×106/ml；细胞加9 倍体积的70%冰乙醇,于-20℃固定至少12 h；离心收集细胞后，用PBS 洗细胞以除去乙醇，细胞重悬于500 μl PBS 中；加入RNase A，使其终浓度为0.25 mg/ml, 37℃,反应30 min；加入5 μl PI 室温避光染色30 min；流式细胞仪检测凋亡率。
       2.3  肝/体重比及组织学染色
       取小鼠全部肝组织,沾除血渍,测肝重,计算肝/体质量比。取肝组织,中性福尔马林固定,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察，高倍镜下随机选取10个高倍视野，观察其形态学变化，计数凋亡细胞。
       2.4   TUNEL反应
       按照Roche Applied Science公司TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书操作步骤进行，光镜下观察，高倍镜下随机选取10个高倍视野，观察凋亡细胞形态并计数凋亡细胞。
       2.5  统计学处理
       所有数据通过SPSS11.0统计软件处理，计量资料以±s表示,两组间比较采用t检验, P<0.05认为有统计学差异。
       3  结果
       3.1   流式细胞仪分析凋亡率流式细胞仪分析表明（见表1），凋亡对照组凋亡率明显高于空白对照组及非凋亡对照组（P＜0.01）；与凋亡对照组比较，达肝清高、中剂量组肝细胞凋亡率有显著差异（P＜0.01），达肝清低剂量组肝细胞凋亡率虽低于凋亡对照组但无显著性差异（P＞0.05）。表1  流式细胞仪检测肝细胞凋亡率（略）
       3.2  组织学改变及肝/体质量比如表2所示，与非凋亡对照组相比，凋亡对照组小鼠肝/体质量比回落13.5%，达肝清高、中、低剂量组分别回落1.2%，7.5%，8.4%。各组动物肝组织HE染色，高倍镜下可见（见图1，表2），凋亡对照组有散在凋亡小体，凋亡细胞胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象；达肝清高剂量组、中剂量组凋亡细胞数量明显低于凋亡对照组（P＜0.01），部分肝细胞轻度浊肿变性，肝细胞间散在淋巴细胞浸润，汇管区有少量炎细胞浸润。表2  组织学染色结果及肝/体质量比（略）
       3.3 TUNEL反应凋亡对照组可见单个散在分布的凋亡细胞，凋亡细胞胞核着棕黄色或棕褐色, 核固缩或染色质浓聚附边。非凋亡对照组及达肝清高、中剂量组无明显凋亡现象，凋亡细胞数与凋亡对照组比较有显著差异（P＜0.01）。达肝清低剂量组仍有散在凋亡小体等改变, 凋亡细胞数与凋亡对照组比较无显著差异（P＞0.05）(见表3，图2 )。表3  Tunel法检测凋亡细胞数（略）
       4 讨论
        肝细胞的异常凋亡在急、慢性肝损伤的发病机制中起着重要作用［4，5］，从肝细胞异常凋亡的角度观察保肝药物的作用及机制具有重要意义。PB能诱导动物肝脏增殖,停药后增殖迅速回落,这种回落是一个典型的凋亡过程［5］。本研究采用撤除PB引起肝细胞异常凋亡为模型, 通过流式细胞术、HE染色、Tunel染色法，观察达肝清对小鼠肝细胞异常凋亡的抑制作用。
        本实验中，凋亡对照组，HE染色可见散在凋亡小体，凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象；TUNEL法检测可见凋亡细胞胞核着棕黄色或棕褐色, 核固缩或染色质浓聚附边，且凋亡对照组凋亡细胞计数明显高于非凋亡对照组及空白对照组，提示肝细胞异常凋亡模型复制成功。同时实验结果表明，达肝清在以34，17 g/kg剂量灌胃给药时，凋亡细胞计数明显低于凋亡对照组，能明显抑制苯巴比妥钠诱导的肝细胞凋亡，提示抑制肝细胞异常凋亡可能为其抗肝损伤的作用机理之一，为临床防治本病以及达肝清的进一步开发利用奠定了良好的基础。
       【参考文献】
         　　［1］邓家刚,覃文慧,涂云燕，等.达肝清抗乙肝病毒、降酶及调节免疫功能临床观察［J］.广西中医药,2007,2,30(1):13.
       
       ［2］邓家刚,郑作文,王 勤，等.达肝清对四氯化碳所致大鼠慢性肝损伤的保护作用［J］.中药药理与临床, 2007，23(2):54.
       
       ［3］邓家刚,郑作文,王 勤,等.八个中药复方对2215细胞HBsAg和HBeAg分泌的影响［J］.广西中医药，2004，27（4）：43.
       
       ［4］王俊学,王国俊,蔡 雄，等.氧化苦参碱及甘草甜素对小鼠肝细胞凋亡的影响［J］.第二军医大学学报,1999,4,20(4):222.
       
       ［5］李平,陈东鸿,程建峰，等.地塞米松及甘草酸对小鼠肝细胞凋亡的影响［J］.中国药理学通报,1999,15(2):143.