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       【摘要】 
       目的分析测定鹅掌草中主要皂苷成分之一anhuienoside E的含量。方法采用C18柱(沃特斯公司，Xterra RP18 3.5 μm，4.6 mm×150 mm)，流动相为甲醇-水(58∶42)，流速1 ml/min，检测波长209 nm。结果皂苷anhuienoside E在2.14～10.70 μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 6)，平均回收率为100.6% ，RSD=1.28% (n=6)。结论该方法简便，灵敏，重复性好，可作为鹅掌草中主要皂苷成分anhuienoside E的含量测定方法。
       【关键词】  Anhuienoside E； 鹅掌草； 高效液相色谱
       Determination of Anhuienoside E in Rhizome of Anemone flaccida by HPLC
       HAN Lin-tao， HUANG Fang，ZHOU Yun-yun， YU Shang-gong， FANG Nian-bai
       Hubei College of Traditional Chinese Medical，Wuhan 430065， China
       Abstract：ObjectiveTo determine anhuienoside E in Rhizome of Anemone flaccida by HPLC. MethodsAnhuienoside E was separated on Xterra RP18 3.5μm  column(4.6 mm×150 mm) with a mobile phase of methanol-water(58∶42) and detected at a wavelength of 209 nm．ResultsThe calibration curve was linear in the range of 2.14～10.70μg(r=0.999 6). The average recovery rate was 100.6% and RSD=1.28% (n=6). ConclusionThe method is simple， sensitive and precise. It can be used for the determination of anhuienoside E in Rhizome of Anemone flaccida.
       Key words： Anhuienoside E；  Anemone flaccida；  HPLC
       
       鹅掌草Anemone flaccida Fr. Schmidt系毛茛科银莲花属多年生植物。该属植物约有150种，世界各大洲均有分布，我国有54种，除海南省外，其它各省均有分布［1，2］，其中鹅掌草在湖北省西部有广泛的分布［1］。该属植物可作药用的有竹节香附A. raddeana、鹅掌草A. flaccida、草玉梅A. rivularis等数种，多以根或根茎入药，具有祛风湿、消肿解毒等功效［1］。现代药理研究表明， 鹅掌草根茎(又名地乌)有抗肿瘤、抗炎、解热镇痛、镇静、抗惊厥等作用，其有效成分为三萜皂苷类 ［2～4］。本文建立了HPLC法测定鹅掌草中分离得到的主要皂苷成分anhuienoside E含量，以后将陆续报道其他含量较高皂苷类成分的含量测定，目的是为进一步开发鹅掌草提供理论和实验依据，使得湖北省西部地区广泛分布的这一植物资源得到更科学合理的利用。
       1  仪器及试药
        美国Agilent 1100serious高效液相色谱仪：四元泵、在线脱气机、柱温箱、可变波长紫外检测器；上海科导超声仪器有限公司BD-2型超声波清洗器(功率：450W，频率：59KHz)；赛多利斯公司BP211D型分析天平。所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。对照品由湖北省中药标准化工程技术研究中心提供［制备色谱分离得到，并经UV，IR，NMR，MS和文献对照［4］，检定为anhuienoside E，即3-O-α-L-吡喃鼠李糖 (1→2) -β-D-吡喃葡萄糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖 (1→4) -β-D-吡喃葡萄糖 (1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，经HPLC按峰面积归一化法检查纯度为99.5%］。鹅掌草根茎采集自湖北省五峰县，中国科学院武汉植物园袁晓博士鉴定，凭证标本保存于湖北中医学院中药标本馆(No.20075321)。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件C18柱(Waters公司，Xterra RP18 3.5 μm，4.6 mm×150 mm)，流动相：甲醇-水(58∶42)，流速：1 ml/min，柱温：40℃，检测波长：209 nm。进样量：对照品溶液和供试品溶液各5 μl。理论塔板数以anhuienoside E峰计不低于2 000。结果见图1～2。
       2.2  对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的皂苷anhuienoside E对照品10.70 mg，置10 ml量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
       2.3  供试品溶液的制备取鹅掌草根茎粉末0.15 g，精密称定，置10 ml量瓶中，加入60%甲醇8 ml超声提取30 min，放冷，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，即得。
       2.4  线性关系考察取对照品溶液2，4，6，8，10 μl分别进样，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积A对进样量m(μg)进行回归，标准曲线为：A=148.640 6m-1.375 41，r=0.999 6 ，其线性范围为2.14 ～10.70 μg。
       2.5  精密度实验取第1批次本品粉末0.15 g，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，取该供试品溶液，连续进样5次，对峰面积进行考察，峰面积的RSD为1.17%，结果表明其精密度良好。
       2.6  稳定性实验取同一份供试品溶液，分别于0，1，2，4，8 h不同时间间隔点样进样分析，对峰面积进行考察，峰面积的RSD为1.22%，结果表明样品溶液在8 h稳定。
       2.7  重复性实验取同一批次鹅掌草根茎粉末5份精密称定，分别按“2.3”项供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别测定其色谱图，并计算其皂苷anhuienoside E的含量，结果其平均含量为83.1 mg/g，RSD为1.03%，说明该法重复性较好。
       2.8  加样回收率实验精密称取已知皂苷anhuienoside E含量的鹅掌草根茎粉末6份各0.075 g，分别加入干燥至恒重的对照品适量，其余操作同“2.3”项中的方法，精密吸取5 μl注入高效液相色谱仪，按所设定的HPLC条件进行测定，结果表明平均回收率为100.6%，RSD=1.28% (n=6)，说明本方法准确度较好。结果见表1。表1  皂苷anhuienoside E加样回收率实验结果（略）
       2.9  样品测定取鹅掌草根茎粉末，按“2.3”项下方法制备各供试品溶液。取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，按所设定的HPLC条件进行测定，每个样品重复测定3次，按外标法计算各样品中皂苷anhuienoside E的含量。结果见表2。表2  样品含量测定结果（略）
       3  讨论
        皂苷anhuienoside E为鹅掌草根茎中含量较高的皂苷成分之一，该皂苷的结构经制备色谱分离纯化，并用紫外光谱、红外光谱、核磁共振波谱、质谱等方法结合文献数据确定其结构，本文笔者研究发现其具有诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用，研究结果另文发表。在了解其活性的基础上，建立anhuienoside E含量测定方法，这对于控制鹅掌草根茎的质量和将鹅掌草根茎中皂苷类成分进一步开发成抗肿瘤新药具有重要的意义。
        本研究预实验比较了超声法和回流提取法，皂苷anhuienoside E测得值无明显差异，而超声处理简便快速，故确定提取方法为超声提取。
       
       将对照品溶液在190～800 nm进行扫描，结果皂苷anhuienoside E的最大吸收波长为209 nm，故选择209 nm作为检测波长。
        从分析结果可知，3批次鹅掌草根茎中皂苷anhuienoside E的含量差别不大，原因可能是采集地点较集中且为同一时间段内采收。今后应考察不同采集地点、不同采集时间鹅掌草根茎中皂苷anhuienoside E的含量，为质量标准的制订提供更全面研究资料。
       【参考文献】
         　　［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］. 北京: 人民卫生出版社， 1988， 28: 1.
       
       ［2］ 张兰天，高石喜久，张彦文，等. 地乌中的三萜皂苷类成分［J］. 中国中药杂志，2008，33(14): 1696.
       
       ［3］邴飞虹，江 俊. 地乌总苷抗组织胺作用研究［J］.中医药学报，1997，14(1): 33.
       
       ［4］Ye W C， Zhang Q W， Zhao S X， et al. Four new oleanane saponins from Anemone anhuiensis ［J］. Chem Pharm Bull，2001，49(5): 632.