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       【摘要】 
       目的建立高效液相色谱法测定地黄寡糖中水苏糖含量方法。 方法采用菲罗门Rezex RPM-Monosaccharide Pb+ +8%（7.8mm×300mm）色谱柱，以水为流动相，流速0.8 ml/min，示差检测器测定地黄寡糖中水苏糖含量。结果在该色谱条件下，水苏糖在0.20～3.20 mg/ml范围内峰面积和进样质量有良好的线性关系，其相关系数为0.999 5。样品平均回收率为99.9%，RSD为1.2%（n=6）。结论该方法灵敏可靠，专属性强，且具有快速、简便、重复性好的特点。
       【关键词】  地黄寡糖； 水苏糖； 高效液相色谱
       Determination of Stachyose Contents in Rehmannia Glutinosa Oligosaccharides by High Performance Liquid Chromatography
       AN Yang,  YANG Jing,YUE Chunli, LIU Ying
       Liaoning Medical College, Liaoning Jinzhou 121001,China
       Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of stachyose contents in Rehmannia Glutinosa Oligosaccharides(ROS).MethodsStachyose was determined with Rezex RPM-Monosaccharide Pb+ +8%（7.8 mm×300 mm）column, water as mobile phase and differential refractive index detector. ResultsThe correlation coefficient between the area of stachyose and stachyose content was 0.999 5. The sample average recovery was 99.9%, the RSD was 1.2 %( n=6). ConclusionThis method is simple, rapid, specific, accurate and reproducible.
       Key words：Rehmannia Glutinosa Oligosaccharides (ROS);   Stachyose;   HPLC
        地黄首载于《神农本草经》，为玄科多年生草本植物（Rehmannia glutinose Libosch）的根。地黄常被作为益智药物使用。地黄饮子治疗血管性痴呆39例，总有效率可达66.67%［1］。地黄饮子证明对中风患者的神经功能恢复具有良好的治疗效果［2］。熟地黄水煎剂可以改善AlCl3导致痴呆小鼠和大鼠的学习记忆功能［3］。尽管地黄的药理作用得到人们认可，但地黄发挥作用的具体成分并不清楚。由于以上地黄制剂在使用时均为其水溶性成分，因此，推断其发挥作用的应为水溶性成分。在此推论的基础上制备了地黄寡糖［4］(Rehmannia glutinosa oligosaccharides，ROS)，研究表明，ROS对缺血再灌导致的大鼠学习记忆损伤具有保护作用［4］；对谷氨酸诱导的神经细胞损伤具有保护作用［5］。为进一步探讨ROS发挥药理学作用的物质基础，对ROS中的水苏糖含量进行了测定。
       1 仪器与试剂
        日本岛津液相色谱仪一套，包括LC-20ATVP色谱泵、RID-10A示差检测器、柱温箱、LCsolution 1.03色谱工作站；KQ-250B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司生产；SYS-550型石英亚沸高纯水蒸馏器，由金坛市丹阳门石英玻璃厂生产；水苏糖对照品，购于北京慧德易科技有限责任公司，纯度99.8%。ROS，自制，批号为20080301，20080302，20080303，20080304，20080401，20080402。
       2 方法与结果
       2.1 溶液的制备
       2.1.1  对照品溶液的制备精密称取水苏糖对照品适量，加水制成每毫升含1.0 mg的溶液，即得。
       2.1.2  供试品溶液的制备即自制ROS，稀释10倍，用0.45 μm的膜滤过，作为供试品溶液。
       2.2  色谱条件 
       色谱柱：菲罗门Rezex RPM-Monosaccharide Pb+ +8%（7.8 mm×300 mm）；流动相：水；流速：0.8 ml/min；柱温：80℃，示差检测器，进样量：10 μl。结果表明供试品溶液在水苏糖位置上有相应的峰存在，且与其它色谱峰可以基线分离。表明水苏糖在此色谱条件下分离良好。理论塔板数按水苏糖计，应不低于3 000。色谱图见图1。      
       2.3 线性关系实验 
       分别精密称取水苏糖对照品，加水配制浓度分别为0.20，0.40，0.80，1.60，3.2 mg/ml的溶液，按色谱条件分别进样10 μl，测得峰面积，以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得线性回归方程为：Y=100 409X-3 340.9，r=0.999 5。结果表明水苏糖在0.20～3.20 mg/ml时，浓度与峰面积呈良好线性关系。
       2.4 精密度和稳定性实验取同一供试品溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，10 μl/次，测定水苏糖峰面积，其RSD为1.2％，表明此法的精密度良好。
       
       取同一供试品溶液，并分别于0，3，6，9，12，24 h，按上述色谱条件，进样10 μl，测定水苏糖含量，RSD为1.9%，表明水苏糖在24 h内稳定。
       2.5  加样回收率实验取供试品6批，分别加入水苏糖对照品1或2 mg，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，进样，计算回收率，见表1，平均回收率为99.91%，RSD为1.20%。表1  回收率实验结果（略）
       2.6  样品的测定取批号为20080301，20080302，20080303，20080304，20080401，20080402，20070101，20070102，20070103的ROS，按上述方法测定水苏糖含量，结果其水苏糖含量均在9.0～12.0 mg/ml之间。
       3 讨论
        水苏糖在192 nm处有吸收，但由于在此波长下干扰大，灵敏度差，因此选用了示差折光检测器，虽然灵敏度低受温度影响大，但由于样品水苏糖的含量高，故灵敏度低的不足得到补偿。
        作者也尝试了利用C18柱及NH2柱，对流动相进行了筛选，但样品均未能进行基线分离。在选用专用分离糖的Rezex RPM-Monosaccharide Pb+ +8%色谱柱后分析效果良好。
       【参考文献】
         　　［1］谢静红.地黄饮子治疗血管性痴呆39例［J］.福建中医药, 2007, 37 (1) : 38.
       
       ［2］何华，王桂香，钟士江，等.地黄饮子对中风恢复期患者神经功能及体感诱发电位的影响［J］.山东医药, 2005, 45（34）: 45.
       
       ［3］崔瑛，颜正华，侯士良，等.熟地黄对动物学习记忆障碍及中枢氨基酸递质、受体的影响［J］.中国中药杂志, 2003, 28 (9) : 862.
       
       ［4］杨菁，石海燕，李莹，等.地黄寡糖对缺血再灌所致痴呆大鼠学习记忆功能的影响［J］. 中国药理学与毒理学杂志, 2008 , 22 (3) : 165.
       
       ［5］史佳琳，杨菁，徐新利.地黄寡糖对谷氨酸诱导海马神经元损伤的影响［J］.中国药理学通报，2009，25（3）：421.