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       【摘要】 
       目的探讨中药桂枝对MRL小鼠心肌细胞凋亡的作用及对Caspase 3基因表达的影响。方法将MRL小鼠分为空白组、强的松组和桂枝组，检测MRL小鼠心肌组织凋亡细胞，计算心肌细胞凋亡指数（AI），ＲＴ-ＰＣＲ法检测心肌细胞凋亡基因Caspase 3表达，观察桂枝对MRL小鼠心肌细胞凋亡的影响。结果桂枝能调控心肌细胞凋亡基因Caspase 3表达，即抑制Caspase 3表达，明显抑制心肌细胞凋亡(心肌细胞凋亡指数显著下降)。其疗效明显优于空白组（P<0.05），有显著性差异，与强的松组疗效相当（P>0.05）。结论桂枝可能通过调控凋亡基因而抑制心肌细胞凋亡，从而延缓或部分逆转MRL心肌损害的发生、发展。
       【关键词】  MRL小鼠； 细胞凋亡； Caspase 3基因表达
       系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一种多因素参与的累及全身多脏器、多系统的自身免疫性疾病，现代医学多采用肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂、非甾体抗炎药等治疗，但有明显的副作用，停药后病情也易反复，治疗现状不容乐观。目前在中医中药领域内寻找治疗SLE及SLE心肌损害的有效药物，并从调控凋亡基因、抑制细胞凋亡切入研究其作用机理，是一项很有裨益的探索。本实验对MRL小鼠应用桂枝进行了该方面的探讨。
       1  材料与仪器
       1.1  动物
       8～10周龄雌性MRL小鼠，体质量20～25 g，由上海动物中心提供。
       1.2  药品桂枝药物由河北工程大学附属教学中医院提供，强的松片由浙江仙居制药厂生产。
       1.3  试剂RNA提取试剂Trizol Reagent购自华美生物工程公司，为Invitrogen公司产品；逆转录酶（AMV-RT ），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase），随机引物（Random primers），琼脂糖（agarose）均购自美国Promega 公司。
       1.4 仪器756型紫外分光光度计为上海精密仪器厂生产；GeneAmp 9600型PCR仪 为美国PE公司生产；RS-28高速低温离心机为 德国贺利氏公司生产；超低温冰箱为德国贺利氏公司生产；UVP凝胶扫描系统由美国UVP 公司生产；微量移液器 为德国Gilson公司生产；DYZ-22A型双恒定时电泳仪为北京市六一仪器厂生产；DYY-Ⅲ桥式电泳仪为北京市六一仪器厂生产。
       2  方法
       2.1  实验分组与给药36只雌性MRL小鼠，随机分为3组，即空白对照组，强的松组，桂枝组，各12只。空白对照组给予生理盐水灌胃1ml/d，强的松组给予强的松混悬液灌胃0.02 g·ml-1·d-1，桂枝组给予桂枝煎剂0.12 g·ml-1·d-1，分两次给予，各组灌胃3周后处死动物，取心室肌组织。
       2.2  检测指标与方法
       2.2.1  心肌细胞凋亡Ladder电泳用碱裂解法提取心肌ＭＤＡ,洗涤,ＴＥ过夜溶解。制备1 5%的琼脂糖凝胶，加入DNA样品，以5V/cm的电压电泳1～2ｈ，紫外透射仪观察DNA条带，成像、照片。
       2.2.2  凋亡及相关基因检测迅速分离心脏,常规石蜡包埋，切片数张。心肌细胞凋亡按末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞核的3’末端。分离MRL小鼠心脏，使用200℃干烤的器械于手术台上留取100 mg心室肌组织，迅速将组织置于4℃DEPC水中洗去血液后，置冻存管中保存于液氮中，M-Caspase 3基因按照相应的RT-PCR实验流程进行检测，引物序列依据文献报道设计，由上海生物工程公司合成，RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶（含GoldView染料）上电泳，120V，25min，用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统（Gel-Pro Analyzer Version 3.0）分析结果。
       2.3  图像分析用图像分析仪900倍放大凋亡和免疫组化切片，每张片随机取10个视野，测定阳性染色的平均吸光度与阳性细胞百分比，计算细胞凋亡指数(AI)。
       2.4  统计方法所有数据用SPSS11.5软件处理。数据以±ｓ表示。多组间比较用方差分析,两两比较用ｑ检验,率检验用χ2分析。
       3  结果
       3.1  桂枝对MRL小鼠心肌组织DNA凋亡Ladder发生率的影响空白对照组MRL小鼠通过DNA琼脂糖电泳可见凋亡Ladder的发生率明显较其它组高。桂枝组和强的松组心肌细胞凋亡Ladder的发生率明显下降，两组与空白对照组相比经χ2检验，Ｐ<0 01，差异有显著性。见表1。表1  各组小鼠心肌细胞DNA凋亡Ladder发生率的比较（略）
       3.2  桂枝对心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响空白对照组MRL小鼠凋亡指数和M-Caspase 3基因表达较高，与之相比，桂枝组和强的松组的心肌细胞凋亡指数和Caspase 3基因表达明显降低，（Ｐ<0.01），差异有显著性。桂枝组和强的松组相比无显著性差异（Ｐ>0.05）。见表2。表2  各组小鼠心肌细胞凋亡及Caspase 3 mRNA基因表达的比较(略)
       4  讨论
        狼疮性心脏病变是系统性红斑狼疮（SLE）常累及的器官病变之一，约30%的SLE患者有心血管表现，约10%的患者有心肌损害，严重者可发生心力衰竭导致死亡［1］。有研究表明SLE心肌损害与细胞凋亡有密切关系［2］。本研究发现MRL小鼠心室肌细胞凋亡明显增加，凋亡指数增高，同时Caspase 3 mRNA 基因表达明显增高，说明MRL小鼠心肌细胞凋亡和Caspase 3 mRNA基因表达存在必然联系，本课题通过观察空白组及治疗组心肌细胞凋亡和Caspase 3 mRNA基因表达的变化，力求探讨桂枝对于MRL小鼠心肌细胞的作用及机理。
        促凋亡因子Caspase 3是半胧氨酸蛋白酶家族中最重要的成员之一，以无活性的酶原形式存在于细胞浆中，在凋亡信号的刺激下经蛋白酶水解作用切去原结构域，形成四聚体而活化，活化的Caspase 3参与了一系列与凋亡有关的细胞变化过程，包括细胞内蛋白底物的降解，凋亡抑制剂的失活，染色质的聚集，促使凋亡小体形成等［3～5］。 Caspase 3介导的细胞凋亡与SLE密切相关。以往大量研究表明系统性红斑狼疮（SLE）在线粒体途径介导的细胞凋亡中，死亡受体与配体交联后经过一系列的过程可最终导致caspase 3活化，引起凋亡的发生［2，6］。本试验中空白对照组、桂枝组MRL小鼠心肌细胞凋亡指数增高，同时Caspase 3 mRNA基因表达亦明显增高，说明MRL小鼠心肌细胞凋亡与Caspase 3 mRNA基因表达之间有必然联系。本研究结果表明桂枝组MRL小鼠心肌细胞凋亡指数明显低于空白对照组，而其Caspase3 mRNA的基因表达低于空白对照组，说明桂枝通过影响Caspase 3 mRNA基因表达，进而抑制MRL小鼠心肌细胞凋亡，从而降低了MRL小鼠的心肌细胞凋亡指数。桂枝对MRL小鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用。
        桂枝，辛，甘，温，归心、肺、脾、膀胱经，用于治疗胸痹心痛首见于《金匮要略》，叶天士又创出辛味通络法，扩大了桂枝治疗心脏疾病的适应症和治法，《本经疏证》总结:“和营、通阳、利水、下气、行瘀、补中，为桂枝六大功效。”桂枝是辛味通络的要药，临床适用于气虚、阳虚、气滞、寒凝、血瘀、痰浊等证型心绞痛病人［7］。以往关于桂枝的临床和实验研究表明，桂枝中含有桂油和桂皮醛，具有扩张皮肤血管，解痉镇痛强心和降血脂的作用，在冠心病治疗中有着重要作用［8，9］。但以往研究没有涉及桂枝对狼疮小鼠心脏病变的影响，以及桂枝对狼疮小鼠心肌细胞凋亡及相关基因的研究探讨。
        本实验结果表明桂枝可以明显抑制Caspase 3 mRNA基因表达，与强的松组相比差异无显著性（Ｐ>0.05）。据此可以推测桂枝抑制心肌细胞Caspase 3 mRNA基因表达是其抑制心肌细胞凋亡，减轻SLE心脏病变的分子免疫学机制之一。本试验桂枝对SLE心脏病变的研究是对中药治疗SLE及作用机理的初步探索，尚需进一步的实验印证和深入研究，以深化中医药在该领域的研究，推动其进一步应用和发展。
       【参考文献】
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