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       【摘要】 
       目的探讨下丘脑衰老时神经递质的变化及何首乌饮延缓下丘脑衰老的作用机制。方法D-半乳糖连续腹腔注射致亚急性衰老动物模型，造模后灌胃何首乌饮连续60 d后，大鼠断头取下丘脑。采用ELISA法检测各组大鼠SP，β-EP和GnRH的含量；高效液相色谱法（HPLC）以SHIMADZU-10A 高效液相色谱仪和L-ECD-6A电化学检测器检测下丘脑单胺类神经递质NA，DA，5-HT的含量。结果同正常对照组相比，模型组大鼠下丘脑GnRH、SP明显增高，β-EP与NA、DA、5-HT含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，何首乌饮组下丘脑GnRH、SP明显下降，β-EP与NA、DA、5-HT含量显著升高，呈现一定的剂量依赖性。结论 衰老时大鼠下丘脑正常功能被破坏，何首乌饮通过对神经递质紊乱的调节而延缓了下丘脑的衰老。
       【关键词】  何首乌饮； 下丘脑； 神经递质
       Influence of Heshouwuyin on Neurotransmitter in Hypothalamus Brain in Female Aging Rats
       LI Yali, ZHANG Na, PANG Xiaojing, GAO Fulu, WANG Fangna, QI Xuan5, CHEN Xue
       1. Center of Birth Health, Excellent Growth and Education, The People’s Hospital of Hebei Privince,Shijiazhuang 050051,China; 2. The Forth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang,050011,China; 3.Institute of Basic Medical SciencesChengde Medical College,Chengde,067000,China; 4. Hebei Normal University,Shijiazhuang 050016,China; 5. Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the changes of hypothalamus brain neurotransmitter of aging rats and mechanisms of Heshouwuyin(HSWY) on anti hypothalamus aging.Methods The sub-acutely aging model was continually induced by ip injection of  D-galactose in rats. Oral HSWY was administered once daily for 60 days after aging induction.The rats were killed by being amputated by head and the hypothalamus was taken. Use the method of ELISA to detect SP, β-EP and GnRH. The concentration of monamine transmitters including noradrenaline (NA), dopamine compared with the normal group (P<0.05). HSWY dose-dependently decreased the  (DA) and 5-hydroxypatmien(5-HT) in hypothalamus were detected by high-performance liquid chromatography (HPLC), with electrochemical detection.Results GnRH and SP of rats in the model group increased significantly, β-EP , NA, DA, 5-HT concentration decreased remarkably determination of GnRH and SP in hypothalamus, and raised the concentration of β-EP NA, DA, 5-HT. ConclusionThe normal function of hypothalamus is disturbed in aging rats. HSWY has the effects on preventing and delaying senescence of hypothalamus by regulating the disorder of hypothalamus neurotransmitter.
       Key words：Heshouwuyin (HSWY);  Hypothalamus brain;  Neurotransmitter
        中枢神经递质含量改变与衰老密切相关。衰老时下丘脑内的神经递质含量发生相应的增龄性变化，有研究提示下丘脑神经元分泌单胺类神经递质活性下降可能与性腺轴衰老有关，报道改变中枢神经递质水平可以延缓衰老，恢复老年大鼠的性周期活动［1］。在衰老机制和中医传统研究中，对性腺轴衰老的研究多数停留在研究靶组织变化的阶段，对神经内分泌系统上位腺体的研究较少。
       
       我们根据肾虚衰老学说确立了补肾填精原则，制定了补肾方剂-何首乌饮。何首乌饮是由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成。本研究采用D-半乳糖致亚急性衰老的雌性大鼠模型，分别检测各实验组大鼠下丘脑内单胺类神经递质NA、DA、5-HT和神经肽GnRH、SP、β-EP含量的变化情况，旨在探讨衰老过程中下丘脑神经递质的变化及何首乌饮对下丘脑衰老的干预作用。
       1  材料
       1.1  实验动物的选择选用清洁级8周龄雌性SD大鼠105只，体质量180～220 g(购自河北医科大学实验动物学部，合格证编号:605106)。根据实验目的和要求将SD大鼠随机分为以下各组，正常对照组（15只）、模型组（15只）、何首乌饮延缓衰老组（高、中、低剂量组各15只）、自然恢复组（15只）、VE阳性对照组（15只）。
       1.2  动物模型的建立和各组动物的处理用D-半乳糖连续腹腔注射建立亚急性衰老动物模型：用生理盐水配成6%的溶液，按300 mg·kg-1·d-1给药，连续60 d,1次/d。延缓衰老组和阳性对照组大鼠在造模成功后每天灌胃何首乌饮、维生素E，连续60 d；自然恢复组每天灌胃生理盐水，时间同上。
       1.3  药物溶液的制备何首乌饮方剂组成：何首乌（炙）、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓等，按重量比3∶2∶3∶2∶5∶3比例混合，剪碎，水浸泡1 h，然后水煎2次，30 min/次，过滤后浓缩至含生药分别为2.4，4.8，9.6 g/ml（分别作为低、中、高剂量药液）。4℃保存，给药前复温至25～30℃。维生素E溶液：用0.5%羧甲基纤维素钠稀释为含维生素E 0.005 5 g/ml药液。4℃保存，给药前复温至25～30℃。
       1.4  标本的采集及处理动物断头处死，取出全脑后迅速投入液氮中，保存待测。
       2  方法
       2.1  下丘脑GnRH、SP和β-EP含量的测定用直径2.5 mm的套管刀在大鼠脑腹侧视交叉后方打孔取下丘脑，组织柱长约5 mm，称重，匀浆器中加入800 μl细胞裂解液（0.15 mol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 1%TritonX-100, 10 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl, 1∶1000的5 mol/L DTT, 1∶1000的100mmol/L PMSF），冰浴下将组织研磨成浆后4℃离心取上清。分别用双抗夹心ELISA法检测GnRH、SP、β-EP（GnRH、SP、β-EP试剂购自R＆B公司）。
       2.2  下丘脑单胺类神经递质含量的测定
       2.2.1  对照品溶液的配制精确称取对照品去甲肾上腺素
       （noradrenaline, NA）、多巴胺（dopamine, DA）、5-羟色胺（5-hydroxytrypatmien, 5-HT），配成浓度分别为30，15，10 ng/μl的标准混合溶液500 ml。（NA、DA、5-HT试剂购自FLUCA公司）。
       2.2.2  样品制备取下丘脑，称重后置于400 μl  0.1 mol/L高氯酸溶液中，冰浴下用内切式匀浆器匀浆，4℃离心40 min，取上清液10 μl进样。
       2.2.3  色谱条件流动相：乙酸钠缓冲液-甲醇（96∶4），过饱和柠檬酸调pH=4.9；流速：1.2 ml/min；色谱柱：Discovery C18 (250 mm×4.6 mm)5 μm；柱温：室温。
       
       精密量取上述对照品混合溶液各0.1，1，3，6 ml，分别置于10 ml容量瓶中，双蒸水稀释至刻度，得到一系列浓度的标准品混合溶液，分别取10 μl进样，记录峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积积分值为从纵坐标作标准曲线，并进行回归计算，所得回归方程分别为：NA：Y=69.319 6+70 146.292 7X，r=0.999 9；DA：Y=3 557.920 3+7 771 405X，r=0.999 8；5-HT：Y=-9 252.252 8+168 666.729 5X，r=0.999 9。
        说明NA在0.290～28.96 ng/μl范围内、DA在0.16～28.96 ng/μl范围内、5-HT在0.102～10.20 ng/μl范围内线性关系良好。
       2.2.4  精密度测定取对照品混合溶液10 μl进样，重复进样5次，分别记录色谱峰面积积分值，计算RSD为1.02%，说明仪器精密度和操作精密度较好。
       2.2.5  溶液稳定性检测将对照品混合溶液在0，1，3，5，7 h分别进样，进样量为10 μl，分别记录色谱峰面积积分值，计算RSD为2.31%，说明在7 h之内对照品混合溶液基本稳定。
       2.2.6  回收率测定在4组下丘脑组织匀浆上清液中以一组为空白组，另三组分别加1，2，3 ng的NA、DA、5-HT标准混合液，10 μl进样。测得值分别减去空白组测得值，然后分别除以1，2，3，得回收百分率。各组n=5，结果见表1。结果表明上述含量测定方法回收率良好。
       2.3  统计学分析所有数据均以±s表示，应用SPSS 11.5统计软件进行统计处理，用One-Way ANOAY方差分析，均数间两两比较行SNK法Q检验，均以P<0.05作为差异有统计学意义的标准。
       3  结果
       3.1  大鼠下丘脑单胺类神经递质含量变化模型组大鼠下丘脑NA、DA、5-HT与正常组相比，含量明显下降（P<0.05）；何首乌饮组同模型组相比，NA、DA、5-HT含量明显提高。以何首乌饮高剂量组效果最显著。结果见表1，对照品色谱图见图1,下丘脑色谱图见图2。
       3.2  下丘脑GnRH、SP和β-EP的变化模型组下丘脑GnRH、SP明显增高，β-EP明显降低，与正常组相比有显著差异（P<0.05）；何首乌饮能够明显提高β-EP的含量，降低GnRH、SP的浓度，何首乌饮高剂量组明显好于其它各组（P<0.05）。结果见表2。表1  何首乌饮对衰老雌性大鼠下丘脑单胺类递质的影响（略）表2  何首乌饮对雌性大鼠下丘脑 GnRH, SP, β-EP 的影响（略）
       4  讨论
        下丘脑神经递质平衡被破坏是人体衰老的重要原因之一。下丘脑有多种神经递质，主要为单胺类递质和肽类递质，它们是调节下丘脑功能的主要物质。在正常情况下，中枢神经递质的分泌维持在一定的水平，相互间比例协调，随着机体的老化，中枢神经递质也发生增龄性改变，从而引起一系列功能紊乱症状的发生。
        单胺类递质对GnRH神经元的功能活动有较大的影响。NA促进GnRH的基础分泌及排卵期前或甾体类性激素诱导的以GnRH为中介的LH峰的形成［2，3］，DA抑制GnRH的释放，但能上调GnRH的基因表达，据报道DA2受体激活后可减少电压依赖性Ca2+通道Ca2+内流量，从而使GnRH分泌量减少［4］。有些研究表明5-HT抑制下丘脑GnRH释放并因此抑制LH 释放。脑室注射5-HT使LH释放减少，电剌激中缝核5-HT 能神经元能抑制大鼠LH释放。研究表明衰老时下丘脑单胺类神经递质NA、DA和5-HT的含量下降［5］。
        GnRH是调节下丘脑-垂体-卵巢轴生殖内分泌的关键因子，影响脑垂体FSH和LH的合成与分泌。β-EP 对女性生殖内分泌的调节具有中枢作用， 它对GnRH起抑制作用；促进LH的分泌［6］；阻止卵巢颗粒细胞分泌过多的孕酮，通过促进催乳素释放而影响卵巢排卵［7，8］；体内β-EP水平降低可使下丘脑-垂体-卵巢轴紊乱，导致卵巢内分泌失调［9］。SP在下丘脑水平对垂体LH、FSH和卵巢激素生成均有明显的抑制作用。随着年龄的增长，下丘脑内神经肽类递质的含量亦发生增龄性变化。
        我们的研究发现，同正常组相比，模型组大鼠下丘脑合成NA、DA、5-HT和β-EP减少，GnRH、SP增加，证实下丘脑正常功能被破坏。提示大量D-半乳糖进入体内后引起脂质过氧化和物质代谢障碍，导致了大鼠下丘脑神经递质合成、代谢紊乱，进而引发激素分泌的改变，使得神经内分泌机能降低。
       
       本实验发现：何首乌饮能显著提高衰老大鼠下丘脑的NA、DA和5-HT的含量，其中以何首乌饮高剂量组效果最明显。说明何首乌饮可以通过提高下丘脑的单胺类神经递质的水平，以调节神经系统的平衡，缓解神经系统的老化。衰老大鼠下丘脑GnRH、SP含量增高，而β-EP出现代偿性降低，何首乌饮明显提高了下丘脑β-EP的含量，降低GnRH、SP的浓度。综上所述，我们的研究表明：何首乌饮通过改善下丘脑的单胺类和肽类神经递质的水平来延缓下丘脑的衰老。
        
       【参考文献】
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