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       【摘要】 
       目的探讨胡椒醇提液外用对兔耳轻度冻伤的治疗效果。方法用－15℃左右低温液复制兔耳轻度冻伤模型，冻伤后48h开始在兔冻耳涂抹胡椒70%乙醇提取液治疗，2 d后测定血清中SOD活性、MDA和TNF-α含量，4 d后评价冻耳外观正常与否及变形程度，制作冻耳组织病理切片，显微镜下观察冻耳组织病理变化，同时测定血清与冻耳组织中SOD活性、MDA和TNF-α含量。结果用胡椒70%乙醇提取液治疗2 d后血清中SOD活性显著增加，MDA量显著降低，TNF-α量无明显变化。治疗4d后血清中SOD活性、MDA和TNF-α含量均无明显差异，但冻耳组织中SOD活性与TNF-α水平显著提高，MDA量显著降低。另外冻耳外观评价与组织病理检查显示冻耳组织坏死范围减少，修复速度明显提高。结论胡椒70%乙醇提取液局部外用对轻度冻伤有治疗作用。
       【关键词】  胡椒； 冻伤； 治疗作用
       Experimental Study of Alcohol Extract from Pepper in the Treatment of Frostbite on Rabbit Ear
       DENG Yongkun, LAI Yong, DONG Shou-tang, WANG Yinhui, LI Fengxian
       Department of Pharmacology, College of Pharmacological Science, Dali University, Dali 671000, China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of alcohol extract from pepper on mild and moderate frostbite of rabbit ear. MethodsThe right rabbit ear, within 7 cm scope from apex conchae auris toward sulcus auriculae posterior, was immersed into cold liquid at -15℃ to establish an experimental model of mild and moderate frostbite. 2 d after frostbite, 70% alcohol extract from pepper was applied onto surface of ears frozen. SOD activity, MDA and TNF-α levels in serum were determined 2 and 4 d after treatment. Then after application for 4 d, SOD activity, contents of MDA and TNF-α in tissue of ear frozen were detected. In addition, the recovery profiles of ear frozen like appearance variables and histopathologic features were surveyed.ResultsSOD activity in serum significantly increased 2 d after treatment with 70% alcohol extract from pepper, MDA level significantly decreased and TNF-α level had no difference. SOD activity, MDA and TNF-α concentrations in serum showed no differences after administration for 4 d.In tissue of the affected ear, SOD activity and TNF-α contents were obviously at high levels at this time, MDA content was the opposite. On the other hand, the appearance review and histopathologic examination both manifested that topical application of 70% alcohol extract from pepper diminished necrotic regions of ear frozen, accelerated tissue repair after frostbite. Conclusion 70% alcohol extract of pepper has pharmacological activity on mild and moderate frostbite healing.
       Key words：Pepper;  Frostbite;    Therapeutic effect
       
       胡椒是传统中药，为胡椒科植物胡椒Piper nigrum L.的干燥近成熟或成熟果实。民间有用胡椒粉煮水或泡酒擦洗患处治疗冻疮的用法，并且疗效确切。笔者所在研究组欲对胡椒抗冻疮作用进行动物实验验证，通过查阅中外文献数据库（包括中国CNKI和VIP科技论文全文数据库，美国Gale、Pubmed和HighWire Press数据库），未能检索到动物冻疮实验模型的报道。研究组曾根据冻疮病因病机试制动物冻疮模型，但均未成功。临床上认为Ⅰ，Ⅱ度（轻度）冻伤和冻疮的临床表现及治疗基本一致，因此在没有冻疮动物模型可用的情况下，药物对轻度冻伤的疗效仍可作为对冻疮治疗作用的参考，有积极意义。
       
       兔耳冻伤后由于局部细胞发生变性或坏死，兔耳形态和组织结构会有所改变，变性的细胞如及时恢复供血供氧，清除损伤因子，能转为正常，反之，如持续缺血缺氧，则损伤可进一步加重，直至坏死。坏死表皮可由周围正常表皮再生修复，真皮坏死则只能通过肉芽组织填补修复，修复后兔耳形态和组织结构不能恢复正常；另外，因冻伤后机体氧化抗氧化系统平衡被打破，丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）这对反映组织氧化损伤程度与抗氧化能力的生化指标会发生相应变化；近年来肿瘤坏死因子α（TNF-α）在创伤和创伤修复中的作用越来越受人们关注。现已证实，在创伤修复早期TNF-α能诱导白细胞脱颗粒，增强其吞噬能力，加速肉芽组织及肉芽组织内新生血管形成［1～3］。在修复中、后期高浓度TNFα能抑制成纤维细胞胶原蛋白基因的转录,同时可以引起胶原酶基因转录的显著增加,因而TNFα在组织的重塑中具有重要意义，可减少瘢痕组织形成，提高修复质量［4，5］。也就是说，在创伤修复早期适当浓度的TNFα能加速创面修复，中、后期高浓度TNFα能提高修复质量［6］。该文通过观察冻伤兔耳治疗后外观形态与组织病理改变情况，测定血清和冻耳组织中MDA、SOD、TNF-α含量综合评价胡椒局部外用对兔耳轻度冻伤的治疗作用，进而研究胡椒抗冻疮的效果。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器 
       2010型酶标仪（奥地利Anthos Labtec Instruments公司）；756MC紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
       1.2 试药 
       取白胡椒（购自东骏大药房），用70%乙醇冷浸3次（48，24，24 h），合并浸提液，静置分层，过滤，滤液用70%乙醇配制为高、中两种浓度供试液，每毫升分别相当于生药3.30，1.65 g；MDA和SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：20071228，20071227）；TNFα试剂盒（美国Adlitteram Diagnostic Laboratories公司，批号：RT110371）。
       1.3 动物 
       日本大耳白兔40只，体质量2.0～3.0 kg，雌雄兼用，由昆明医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（滇）2005-0008。
       2 方法
       2.1  冻伤模型复制与给药
       ［7］取家兔分为4组，即正常、溶剂和高、中浓度胡椒供试液组，每组10只，于实验室正常单笼饲养6 d后将右耳耳尖至耳根7 cm范围剪毛，隔日将右耳剪毛区域浸入（-15±1）℃冷冻液（6份碎冰+1份氯化钠）中，正常组除外。待兔耳变白变硬后再冻30 s，取出，空气中停留20 s后以35℃温水复温20s，取出兔耳，擦干水分，冻伤模型复制完毕。冻伤后48h开始在冻伤兔耳剪毛区域分别涂药，1 ml/次，3次/d，涂药4 d后，治疗结束。
       2.2 冻耳治疗后外观评价 
       冻耳皱缩变形的范围大小反映了组织细胞坏死和瘢痕修复的范围大小，是药物对冻伤所致组织细胞变性的保护和促恢复作用的直接体现。此处将冻耳治疗后外观评价由好到差分为4级：正常（冻耳治疗后颜色、外观、触感和厚度与正常兔耳完全一样）、轻度变形(冻耳耳尖至耳根方向2 cm区域内皱缩变形)、中度变形(耳尖至耳根方向4 cm区域内皱缩变形)、重度变形(耳尖至耳根方向皱缩变形范围超过4 cm)。
       2.3 冻耳病理检查 
       治疗4 d后，家兔左耳耳缘静脉空气栓塞致死，立即沿浸冻线剪下冻耳浸冻部分，由耳尖垂直于浸冻线方向将冻耳浸冻部分剪成对称的两半，一半以4%甲醛溶液固定（另一半留做SOD、MDA和TNF-α测定），分别在耳尖向耳根方向1，2，3 cm处取材，常规石蜡包埋，HE染色，以正常兔耳为对照，显微镜下观察冻耳组织病理变化。
       2.4  SOD、MDA和TNFα测定
       ［8］涂药2 d后，左耳中央动脉取血约4 ml。涂药4 d后心脏取血约4 ml，取“2.3”项下病理检查剪下的另一半冻耳，剪取耳尖部，置事先盛有预冷生理盐水的小烧杯中，涮洗几下，取出，滤纸吸干水分，称1 g耳尖部组织，用10ml预冷pH7.4的0.01 mol/L的PBS制备组织匀浆。血液与组织匀浆4℃分别以4 000 r/min和2 000 r/min离心10 min，取血清和耳组织匀浆上清，按试剂盒中操作方法测定SOD总活力、MDA与TNF-α含量。
       2.5 统计 
       所有数据均用SPSS13.0统计，其中冻耳治疗后外观评价用秩和检验Mann-Whitney U法，SOD、MDA和TNFα测定结果用方差分析LSD法。
       3 结果
       3.1  冻耳外观变化 
       复温后兔耳开始发红发热，随后变紫、肿胀、下垂。肿胀逐渐加剧，12 h后部分兔耳出现浆液性水泡，泡液无色或淡黄色，随后水泡增大或新水泡形成。24 h后肿胀程度不再增加，水泡不再增大或无新水泡形成。48 h后部分兔耳冻区有黄色液体渗出。治疗后冻耳肿胀逐渐消退，治疗结束（治疗4 d）后各组冻耳均已不见明显肿胀。高、中浓度胡椒供试液组治疗结束后分别有4只和2只家兔冻耳外观同正常兔耳（冻耳表皮光滑平整，未见坏死，冻耳颜色、触感、弹性和厚度均与未冻伤的左耳完全一样），其它家兔冻耳均有不同程度的皱缩变形和硬化、表面凹凸不平、表皮坏死，个别家兔冻耳表面有硬痂产生。高浓度胡椒供试液组治疗结束后冻耳外观评价明显好于溶剂组（P<0.01）。结果见表1。表1  胡椒对轻度冻伤兔耳形态改变的影响（略）
       3.2 冻耳治疗后病理变化
       治疗后高、中浓度胡椒供试液组兔冻耳表皮均修复完整，真皮水肿及炎症均明显消退，部分兔冻耳真皮已无水肿和炎症表现（高浓度5只，低浓度3只），近半数兔冻耳毛囊和皮脂腺数量正常（高浓度6只，中浓度4只），未见毛囊和皮脂腺坏死，冻耳总体恢复程度和速度明显好于溶剂组，见图1。
       3.3 SOD测定结果 
       治疗2 d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中SOD活力均显著高于溶剂组（P<0.01）。治疗4 d后各组血清中SOD活力已无明显差异，但冻耳组织中SOD活力有明显不同，高、中浓度胡椒供试液组显著高于溶剂组（高浓度P<0.01，中浓度P<0.05）。结果见表2。表2  胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中SOD活力的影响（略）
       3.4  MDA测定结果 
       治疗2 d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中MDA量显著低于溶剂组（P<0.01）。治疗4 d后各组血清中MDA量均一定程度下降，与正常组相比已无明显差异，但此时冻耳组织中MDA量有差异，高、中浓度胡椒供试液组显著低于溶剂组（高浓度P<0.01，中浓度P<0.05）。结果见表3。表3  胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中MDA含量的影响（略）
       3.5  TNF-α测定结果 
       治疗2 d和4 d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中TNF-α量与溶剂组相比均无明显差异，但治疗4 d后冻耳组织中TNF-α量显著高于溶剂组（P<0.01）。结果见表4。表4  胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中TNF-α含量的影响（略）
       4 讨论
        兔耳冻伤后形态改变的范围实际上反映了冻耳存活的组织细胞面积和存活量。所以，治疗结束后，通过兔冻耳外观正常与否及形态异常范围可评价药物抗冻伤的疗效，药物如能减少耳冻伤后细胞坏死的数量和范围，则冻耳形态改变区域就小。此次研究结果显示，高浓度胡椒供试液能显著降低兔耳轻度冻伤后形态改变程度（P<0.01）,并且治疗结束后4/10冻耳形态与正常兔耳完全一致。
        冻伤4 d（治疗2 d）后兔血循环中SOD活力还明显低于正常，相应的脂质过氧化物MDA含量明显高于正常，但胡椒供试液能显著增强血液中SOD活力，减少MDA的产生。冻伤6 d（治疗4 d）后血循环中SOD活力和MDA水平基本恢复正常，但冻耳组织中SOD活力明显低于正常，另外MDA量也明显高于正常，更有意义的是胡椒供试液能显著增加冻耳组织中SOD活力并降低MDA水平。由此说明，兔耳局部轻度（主要是Ⅱ度）冻伤后不仅能打破受冻局部组织氧化抗氧化系统的平衡，并且因此可使全身血循环中氧化抗氧化系统受累，最终导致失衡。氧化抗氧化系统失衡的顺序为局部冻伤组织到全身血循环，而恢复的顺序则正好相反。另外实验结果也说明，冻伤局部应用胡椒70%乙醇提取液能有效增加机体抗氧化能力，抑制受冻组织氧化损伤。
        兔冻耳局部胡椒供试液治疗2 d和4 d后血液中TNF-α水平与溶剂组相比均无明显差别，值得关注的是，治疗4 d（冻伤6 d）后冻耳组织中TNF-α含量显著高于溶剂组。前面已经述及在修复中、后期高浓度的TNF-α能促进组织重塑，提高修复质量，这与冻耳治疗后外观评价、组织病理及MDA与SOD活力测定结果相吻合。
        兔足轻、重度冻伤后72 h内SOD活性和MDA量的变化［9］、大鼠重度冻伤后72 h内SOD活性、MDA和TNF-α含量的变化［10］国内已见报道，但冻伤后更长时间的上述指标的定量及变化还没有文献，加之冻伤后生化指标变化的研究报道数量很有限，所以药物抗冻伤的药效研究都未就冻伤后这些指标的变化进行测定。此次胡椒对兔耳轻度冻伤的作用研究中SOD活性、MDA和TNF-α含量变化测定结果对药物抗轻度冻伤和冻疮药效评价有一定参考价值。
       【参考文献】
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