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       【摘要】 
       目的动态检测虎眼万年青总皂苷对二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝癌变过程中肝组织中Ki67、血管内皮生长因子受体（Flt-1）表达的影响。方法二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌变，虎眼万年青总皂苷干预，运用免疫组化方法观察并分析第12周末、14周末、18周末肝组织标本中Ki67、Flt-1的表达。结果肝癌变过程中以12周模型组Ki67 LI表达最高，14周及18周模型组Ki67 LI逐渐降低，与12周模型组比较有统计学意义。虎眼万年青总皂苷作用的12周预防组Ki67 LI较低且与相应12周模型组有统计学意义。诱癌14周模型组Flt-1 LI表达最高， 12周及18周模型组Flt-1 LI相对低下，与14周模型组比较有统计学意义。虎眼万年青总皂苷作用的14周预防组、治疗组Flt-1 LI降低，且与模型组有统计学意义。结论二乙基亚硝胺诱发的肝癌变过程中以肝损伤、硬化阶段肝细胞增生活跃，而虎眼万年青总皂苷干预此阶段的肝细胞增生。二乙基亚硝胺诱发的肝癌变过程中在肝癌发生阶段Flt-1表达较高，虎眼万年青总皂苷干预此阶段Flt-1表达。
       【关键词】  虎眼万年青总皂苷； 二乙基亚硝胺； 肝； 实验； Ki67； Flt-1
       The Expression of Ki67 and Flt-1 in the Hepatic Tissue in Hepatocarcinogenesis and the Effect Interfered with Ornithogalum caudatum Ait Total Saponin
       QIAN Changshi, JIN Xinglin, DU Xichen, PIAO Dongming, JIN Jingshun, WU Yanling
       1.Department of Hepatobiliary Surgery,Affiliated Hospital, Yanbian University, Jilin Yanji 133000, China; 2.Pharmacological School, Jilin University, Yanji 133000, China
       Abstract：ObjectiveTo study the dynamic expression of Ki67 and Flt-1 in the hepatic tissue in diethylnitrosamine(DEN)_induced hepatocarcinogenesis and the effect interfered with Ornithogalum caudatum Ait total saponin(OCA-TS). MethodsKi67 and Flt-1 were observed with immunohistochemical staining in DEN_induced hepatocarcinogenesis after 12 weeks,14 weeks and 18 weeks respectively.ResultsThe expression of Ki67 labeling index (LI) were significantly higher in the group of experiment than the normal group. The expression of Ki67 LI were the highest in the 12 weeks model group, the OCA-TS interfered the expression of Ki67 LI in this periods significantly. And the Ki67 LI decreased gradually in the 14 weeks and 18 weeks model group, there had significant correlation between the 12 weeks model group respectively. And in these periods the OCA-TS interfered the expression of Ki67 LI not too much. We also found the expression of Flt-1 labeling index (LI) were significantly higher in the group of experiment than the normal group. The expression of Flt-1 LI were the highest in the 14 weeks model group, the OCA-TS interfered the expression of Flt-1 LI in this periods significantly. And the Flt-1 LI decreased in the 12 weeks and 18 weeks model group relatively, there had significant correlation between the 14 weeks model group respectively. And in these periods the OCA-TS interfered the expression of Flt-1 LI not too much.ConclusionThe hepatocellular exist hyperplasia in the periods of hepatic trauma and hepatic cirrhosis with DEN induced hepatocarcinogenesis, and the OCA-TS interfered the hepatocellular hyperplasia. The expression of Flt-1 is significantly high in the hepatocellular carcinoma occuring periods, and the OCA-TS interfered the expression of Flt-1 in this periods.
       Key words：Ornithogalum caudatum Ait total saponin(OCA-TS);  Hepatic cancer;  Diethylnitrosamine(DEN);  Experimental;  Ki67;  Flt-1
        虎眼万年青Ornithogalum caudatum Ait为百合科多年生球根植物，原产于非洲南部，民间全草入药，用于抗炎症、抗肿瘤等治疗。虎眼万年青球茎中含有大量的生物碱及化学成分，其中虎眼万年青皂苷（OSW-1）抗P338淋巴细胞白血病活性，是常见抗癌药物喜树碱、阿霉索、紫杉醇抗癌活性的10～100倍，而对正常细胞没有毒性［1］。由于OSW-1提取、合成工艺复杂且较昂贵，给广泛的实验、应用研究工作带来一定困难。为了进一步开发和利用虎眼万年青植物，本实验应用虎眼万年青总皂苷动态检测对二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝癌变过程中肝组织中Ki67、血管内皮生长因子受体（Flt-1）表达的影响。
       1  材料与方法
       1.1  药物提取取植物虎眼万年青，在自然条件下干燥，粉碎成粉。加入95%的乙醇浸泡24 h，纱布、滤纸过滤后，收集滤液，滤渣继续加入乙醇浸泡，同上方法循环 3次，收集滤液，将3次所得滤液合并。滤液经减压浓缩为原来体积的1/5，再用1/3体积的石油醚萃取脱脂，保留水相，再次减压蒸馏后，加水稀释上AB-8柱吸附，反复吸附3次，6～8倍柱体积水洗掉糖后用5倍柱体积95％乙醇洗脱皂苷。所得皂苷洗脱液，经D-280柱脱色后，减压浓缩后蒸干，即为虎眼万年青总皂苷。
       1.2  实验动物及设计雄性Wistar清洁级大鼠76只，体质量130～150 g，购自延边大学医学部实验动物中心。动物适应3 d后开始实验。正常组：整个实验过程中均饮用灭菌自来水及基础饲料，并于18周末宰杀6只。模型组：每日给予基础饲料同时，用灭菌自来水配制浓度为95 μg/ml的二乙基亚硝胺(DEN)溶液（美国Sigma公司，避光保存，新鲜配制)，供大鼠自由饮用，每天更换1次。连续饮用4周后，改饮一般的灭菌自来水4周，再继续饮含95 μg/ml的DEN溶液。并分别于饲养第12周末、14周末、18周末分别宰杀各6只。肝硬化预防组：于实验开始在肝癌模型建立的同时, 根据预实验小鼠虎眼万年青总皂苷的LD50为3.2 g/kg, 以接近于LD50之1/30的剂量，即相当于100 mg/kg的给药浓度，以蒸馏水制成所需浓度的混悬液,每日灌胃并分别于第12周末、14周末各宰杀6只。肝硬化治疗组：第10周后从模型组中随机选出8只，按模型组饲养同时给予虎眼万年青总皂苷100 mg/kg，并于第14周末宰杀。肝癌治疗组：第14周后从模型组中随机选出8只，按模型组饲养同时给予虎眼万年青总皂苷100 mg/kg，并于第18周末宰杀。
       1.3  取材及处理各组大鼠宰杀前禁食12 h，称体质量,乙醚麻醉后, 解剖腹腔，完整分离各组大鼠之肝脏，固定于10%甲醛溶液中，石蜡包埋，制备成 5 μm厚的切片。
       1.4  试剂与方法兔抗多克隆抗体 Ki67 Ab (NeoMarkers公司，浓缩型)，即用型快捷免疫组化MaxVision试剂盒(KIT-5400，福建迈新生物技术开发有限公司)。采用免疫组化二步法，Ki67抗体稀释倍数为 1∶300，进行 Ki67免疫组化染色并观察结果。采用SP法进行Ki-67的染色, DAB显色, 以细胞核出现棕黄色颗粒作为阳性细胞，以PBS代替一抗作阴性对照。Ki-67抗原阳性细胞标记指数（LI）：每例选择染色均匀的5个视野,在200×物镜下计数阳性细胞个数, 取平均值。兔抗多克隆抗体VEGFR1（Flt-1）(NeoMarkers公司，浓缩型)，即用型快捷免疫组化MaxVision试剂盒(KIT-5400，福建迈新生物技术开发有限公司)。采用免疫组化二步法，Flt-1抗体稀释倍数为 1∶200，进行Flt-1免疫组化染色并观察结果。采用SP法进行Flt-1的染色, DAB显色, 以细胞核出现棕黄色颗粒作为阳性细胞，以PBS代替一抗作阴性对照。Flt-1抗原阳性细胞标记指数（LI）：每例选择染色均匀的5个视野,在200×物镜下计数阳性细胞个数, 取平均值。
       1.5  统计学方法全部数据采用 SPSS14 for Windows统计分析软件进行处理，t检验、方差分析。
       2  结果
       2.1  各实验组光镜下形态学改变
       2.1.1  Ki67正常组肝细胞（图1a）；12周模型组以增生结节着色显著（图1b）；12周预防组阳性细胞稀疏（图1c）14周预防组、治疗组以水变性肝细胞着色显著（图1d），肝硬化细胞着色深度强于肝癌细胞（图1e）；14周模型组以肝癌细胞与肝硬化细胞着色相似（图1f）；18周治疗组肝癌细胞与肝硬化细胞着色强度弱，深度相似（图1g）。18周模型组肝硬化与肝癌细胞着色相似（图1h）。
       2.1.2  Flt-1正常组肝细胞无着色（图2a）；12周模型组水变性细胞着色（图2b）或增生结节细胞着色（图2c）；12周预防组汇管区肝细胞着色（图2d）；14周预防组、治疗组肝硬化细胞灶状着色（图2e）；14周模型组变性细胞、汇管区细胞着色强（图2f）；18周肝癌治疗组着色弱（图2g）；18周模型组肝癌细胞着色（图2h）。
       图2  免疫组化染色结果（SP×100）Flt-1的表达
       2.2  各实验组Ki67及Flt-1的指数LI差异
       2.2.1  Ki67中各实验组与正常组间有统计学差异（P<0.01）；模型组12周时LI值最高，12周预防组显著抑制LI值，两组间有统计学差异（P<0.05）；诱癌14周时模型组、预防组、治疗组间无显著性差异（P>0.05）；诱癌18周时模型组与治疗组间无统计学差异（P>0.05）；模型14周、模型18周与模型组12周间均有统计学差异（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。
       2.2.2  各实验组与正常组间均有统计学差异（P<0.01）；以模型组14周LI值最高。12周模型组与预防组间无统计学差异（P>0.05）；14周预防组、治疗组与模型组间均有统计学差异（P<0.01，P<0.05）；18周治疗组与模型组间无统计学差异（P>0.05）；模型组14周与模型组12周，18周间均有统计学差异（P<0.01,P<0.05）。详见表1。
       表1  大鼠肝癌变过程中肝组织中Ki-67 LI与Flt-1 LI检测结果(略)
       
       Ki67中各实验组与正常组间有统计学差异（P<0.01）；*与模型组12周间有统计学差异（P<0.05）；#与模型组12周间有统计学差异（P<0.01）。Flt-1中各实验组与正常组间均有统计学差异（P<0.01）；与模型组14周有统计学差异（P<0.05）；与模型组间有统计学差异（P<0.01）
       3  讨论
        肿瘤的发生及其生物学特性与其异常增殖有着密切关系。因此，药物干预肿瘤细胞增殖的研究已成为关注的热点［2］。Ki-67作为增殖细胞核抗原，是一种敏感而特异的增殖期细胞标志物，在细胞周期的G1，G2，M，S期都表达，其中G2、M期表达最强，G0期不表达，是反映肿瘤细胞增殖活性及其生物学行为的重要参数［3］。Ki67是一种能识别存在于增殖细胞核基质内与细胞增殖相关的核蛋白，能反映肿瘤细胞的增殖活性，是判断肿瘤侵袭力和肿瘤预后的有效指标［4］。
       
       本研究以二乙基亚硝胺作为建立肝癌模型的诱导剂，并以虎眼万年青总皂苷干预，动态检测肝组织标本的Ki67的表达。发现12周模型组以增生结节着色显著，12周预防组阳性细胞稀疏；14周预防组、治疗组以水变性肝细胞着色显著，肝硬化细胞着色深度强于肝癌细胞；14周模型组肝硬化细胞着色与肝癌细胞着色相似；18周治疗组肝癌细胞与肝硬化细胞着色相似，强度弱。18周模型组肝硬化与肝癌细胞着色相似，较强。说明虎眼万年青皂苷具有抑制肝细胞异常增生作用。肝癌变过程中以12周Ki67 LI最高，说明此阶段肝细胞增生活跃，而虎眼万年青总皂苷干预此阶段的肝细胞增生。至14周及18周模型组Ki67 LI逐渐降低，与12周模型组比较有统计学意义。虎眼万年青总皂苷干预的14周及18周Ki67 LI与相应的模型组间统计学无显著性差异。是否能说明肝细胞活跃增生主要发生在肝损伤上硬变期，且进一步说明虎眼万年青总皂苷干预肝细胞异常活跃增生。
        多血供的肝癌结节VEGF及其受体表达较强，肿瘤的生长，局部浸润，远处转移与VEGF及其受体密切相关，VEGF首先来源于旁分泌，在后期肿瘤自分泌是VEGF高表达的重要来源，这可能是肝癌阻断血供后，癌灶能存活，复发和转移的重要原因之一［5］。Kanno et al［6］发现VEGF受体-1(Flt-1)作用是促进血管内皮细胞的迁移. Flt-1基因缺陷的小鼠则显示血管发育的无序紊乱, 显示Flt-1在胚胎血管发育中的调节作用. Flt-1通过一种拮抗VEGF信号的可溶形式对血管生成起着调节作用, 以确保血管生成期间的正确萌芽, Flt-1对血管的萌生和生长有正向调节作用［7］。
        本研究中我们发现12周模型组水变性细胞或增生结节细胞着色；12周预防组汇管区肝细胞着色较明显；14周预防组、治疗组肝硬化细胞灶状着色；14周模型组变性细胞、汇管区细胞着色强；18周肝癌治疗组着色弱；18周模型组肝癌细胞着色。说明虎眼万年青皂苷具有抑制血管增生，具体着色细胞规律，待进一步研究。诱癌14周模型组Flt-1 LI表达最高，虎眼万年青总皂苷作用的14周预防组、治疗组Flt-1 LI降低，且与模型组有统计学意义。说明肝癌诱发过程中以促进期（14周）Flt-1表达较高，虎眼万年青总皂苷在此期干预Flt-1表达，防止肝癌的进一步发展。模型组12周，18周LI相对低下，与14周模型组比较有统计学意义。是否能说明促进血管内皮细胞的迁移主要发生在肝癌变期（14周）且进一步说明虎眼万年青总皂苷具有干预血管内皮细胞迁移的作用。
        虎眼万年青总皂苷对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中Ki67、血管内皮生长因子受体（Flt-1）在肝脏中的表达影响，是否与虎眼万年青皂苷（OSW-1）具有促进肿瘤细胞凋亡［8］ 作用相关，有待进一步深入研究。
       【参考文献】
         　　［1］TANG Yuping. YU Biao.The chemical constituents from bulbs of ornithogalum caudatum［J］.Journal of Chinese Pharmaceuticeal Sciences.2001，10(4)：26.
       
       ［2］Buolamwini JK．Novel anticancer drug discovery［J］.Curt Opin Chem Biol，1999，3：500.
       
       ［3］韩圣华，黄建福. 肝细胞癌Ki-67抗原表达及其意义［J］.中国普通外科杂志，2001，9(1)：42.
       
       ［4］Morsi HM, Leers MP, Jager W, et al. The patterns of expression of an apoptosis-related CK18 neoepitope, the bcl-2 protooncogene, and the Ki67 proliferation marker in normal, hyperplasic, and malignant endometrium ［J］.Int J Gynecol Pathol, 2000；9:118.
       
       ［5］杜滂，魏经国. VEGF及其受体的表达与肝癌的生物学特性关系［J］.放射学实践，2002，17（6）：542.
       
       ［6］Kanno S, Oda N, Abe M, et al. Roles of two VEGF receptors, Flt-1 and KDR, in the signal transduction of VEGF effects in human vascular endothelial cells［J］. Oncogene 2000， 19: 2138.
       
       ［7］Joseph B. Kearney, Nicholas C. Kappas, Catharina Ellerstrom, et al. The VEGF receptor flt-1 (VEGFR-1) is a positive modulator of vascular sprout formation and branching morphogenesis［J］.Blood, 2004，103(7): 4527 .
       
       ［8］Deng L, Wu H, Yu B, etal. Synthesis of OSW-1 analogs with modified side chains and their antitumor activities［J］.Bioorg Med Chem Lett, 2004，14:2781.