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       【摘要】 
       目的建立具有中医湿热症状的血尿动物模型，研究血尿湿热证的发病机制，探讨复方中药金水清口服液对大鼠血尿动物模型的作用机理，以及对实验中相关指标的检测及病理变化。方法建立具有中医湿热症状的血尿大鼠动物模型，造模成功后给予金水清口服液治疗，分别观察金水清对动物模型尿中红细胞及尿蛋白的影响；无菌摘除眼球取血，放射免疫法检测血清中IL-6的含量；光学显微镜下观察动物模型肾组织病理变化。结果金水清可显著降低血尿湿热证动物模型的尿红细胞、尿蛋白及IL-6的含量（P＜0.01），并可抑制肾小球系膜增殖及细胞外基质的积聚。结论金水清可早期减缓控制肾脏炎症并可以减轻肾小管-间质的损害和肾小球和肾小管损伤。
       【关键词】  金水清口服液；血尿大鼠模型; 白细胞介素-6
       小儿血尿病因复杂，涉及的病种也较多，因此，其肾组织病理改变是多样的，但各家报道均以系膜增生性病变（MsPL）为主。我们回顾了1996～2006年国内外重要病理分析文献，提示系膜增殖性肾炎占29.70%，IgA肾病占33.81%［1～5］。目前国内外对血尿尚无公认的动物模型，我们选择了改良血尿大鼠模型观察金水清的疗效机制。
       1  材料与仪器
       1.1  动物6周龄SPF级雄性健康Wistar大鼠50只,体质量（150±20）g,购自湖北省实验动物中心；普通饲料由湖北省医学实验动物中心饲料加工厂提供；高糖高脂饲料由湖北省中医院制剂科生产。
       1.2  试剂牛血清白蛋白(BSA)，购自ROCHE生物工程有限公司；葡萄球菌肠毒素B(SEB)，购自军事科学院微生物研究所；FITC标记的羊抗大鼠IgA，购自美国Sigma公司；FITC标记的兔抗大鼠IgG，购自武汉博士德生物技术有限公司。
       1.3  仪器SHH-500GS人工气候箱，重庆市永生实验仪器厂生产；YC-D205超声波加湿器，北京亚都科技股份有限公司生产。
       1.4  药物金水清煎剂：由漏芦、连翘和甘草各等份组成，先用水蒸气蒸馏提取芳香水，蒸馏后的药渣再煎煮浓缩至1 g/ml，加入上述芳香水与适量防腐剂，混匀，灌封，灭菌即得。湖北省中医院制剂室生产。血尿安胶囊，云南理想药业有限公司生产（批号20060105）。
       2  方法
       2.1  分组动物经普通饲料适应性饲养1周后，尿检尿红细胞、尿蛋白全部为阴性，随机分为5组，每组10只，分别是正常对照组、模型组、金水清早组（以下称金早组），金水清晚组（以下称金晚组）和血尿安组。
       2.2  造模及实验方法
       2.2.1  模型组实验第1天起，隔日灌胃含0.1﹪BSA（含牛血清白蛋白20 mg）的酸化水2 ml，第4周将大鼠置于造模箱中共120 h（温度35℃，相对湿度95﹪），温度和湿度根据室温逐步提升，每天不超过5℃，120 h后移至自然环境。进入恒温恒湿箱之前10 d和恒温恒湿箱造模120 h期间，都以高糖高脂饲料喂养。第6周时定期尾静脉注射1﹪BSA缓冲液10 mg/kg（1次/d连续3次），第8周时复加尾静脉注射SEB（葡萄球菌肠毒素B）0.4 mg/kg，1次/周，连续3周。观察至第12周。
       2.2.2  金早组造模方法与模型组相同。从第7周开始用金水清煎剂按6.3 g/（kg·d）灌胃给药，1次/d，至12周末。
       2.2.3  金晚组造模方法与模型组相同。从第9周开始用金水清煎剂按6.3 g/（kg·d）灌胃给药，1次/d，至12周末。
       2.2.4  血尿安组造模方法与模型组相同。从第9周开始用血尿安按0.38 g/（kg·d）配成水溶液2 ml分别灌胃, 1次/d，至12周末。
       2.2.5  正常组隔日灌服生理盐水2 ml，不再进行其它处理，观察至第12周末。
       2.3  指标的检测及方法实验第12周末分别检测各组大鼠尿红细胞(尿沉渣镜检)、24 h尿蛋白定量（双缩脲法）；取肾组织进行光镜观测；无菌摘除眼球取血，放射免疫法检测血清中IL-6的含量。
       2.4  统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析，各组实验数据以±s表示, 统计分析用单因素方差分析和t检验，检验差异显著性水平设为P<0.05。
       3  结果
       3.1  一般情况和体温实验期间各组实验大鼠无死亡现象。正常对照组大鼠行为、活动等均正常。正常对照组：动物精神状态，活动及反应性，进食、大便性状无明显变化；模型组和各治疗组动物均出现明显的倦怠嗜卧、耸毛、大便烂、进食少、舌质暗红，有的舌苔白腻；部分出现眼眵、腹泻等表现，3～5 d后基本恢复正常。
       3.2  尿红细胞及尿蛋白测定正常组无镜下血尿，0周至第8周末，模一组与其他组比较差异无统计学意义（P>0.05）。第8周末至12周末，模型组和各治疗组与正常组比较，均有非常显著性差异（P<0.01）；模型组与各治疗组比较有非常显著性差异（P<0.01）。说明该模型血尿复制成功，且说明各治疗组药物能降低实验大鼠尿红细胞，金早组稍优于金晚组和血尿安组，金晚组与血尿安组相比差异不显著。
       3.3  光镜组织学变化正常组大鼠肾小球系膜细胞及基质无增生，毛细血管襻开放，肾小管结构规则，间质无增生及炎细胞浸润。模型组大鼠部分肾小球萎缩，个别肾小球呈分叶状，可见弥漫性肾小球系膜区增宽，系膜细胞、系膜基质增生，毛细血管腔狭窄，肾小囊轻度扩张。肾小管间质有炎细胞浸润。金早组肾小球系膜细胞、系膜基质轻度增生，毛细血管腔轻度狭窄，肾小管上皮细胞轻度变性，间质有少量炎细胞浸润。金晚组和血尿安组肾小球系膜细胞、系膜基质轻度增生，毛细血管腔轻度狭窄，肾小囊轻度扩张。肾小管上皮细胞变性，间质炎细胞浸润。
       3.4  血清中IL-6的含量显示与正常组比较，其他组差异有非常显著性（P<0.01）,模型组与各治疗组比较差异有显著性（P<0.05）。说明各治疗组药物能降低各组实验大鼠血清IL-6水平金早组明显优于金晚组和血尿安组（P<0.05），金晚组与血尿安组相比差异不显著。
       4 讨论
        早在20世纪80年代就有资料统计原发性肾小球疾病湿热证的发病率为47.95%～100%，说明湿热证常见于在肾脏疾病。本研究以中医理论为指导，结合小儿生理病理特点及我院儿科，特别是倪珠英教授多年的临床经验，亦认为“湿热”是小儿血尿的主要致病因素，又是其加重且缠绵难愈的病理关键。由于湿热之邪具有双重致病特点，即火热亢盛炎上和湿性黏滞、重浊、固着之性，当两者相合，如油裹面，形成无形之热蒸动有形之湿的趋势，湿热胶着、黏滞难化。日久，必使“稚阴稚阳”之小儿气耗阴伤，导致阴伤虚火内炽，灼伤肾络则血尿难消。且气为血帅，气虚血运无力而瘀血内停；湿阻气机，气滞也致血淤；复与湿热互结，更使病邪难祛，病程绵长。终因脏虚无以祛实，湿热浊瘀壅塞三焦，气化不利，决渎失司，水道闭塞而形成癃闭、关格等病情危重、错综复杂的局面。
         
       金水清正是用清热解毒利湿之品，以防进入湿热粘滞，温清两难的地步，意在早期阻断小儿血尿的病情发展。该方由漏芦、连翘、生甘草等组成。漏芦，苦寒，《本草从新》：“入胃、大肠经，通肺、小肠。”李时珍《本草纲目》也言漏芦可止血。现代药理学研究认为漏芦能降低毛细血管通透性，抑制炎性肉牙肿的形成，在抗炎免疫方面有效，还可对抗红细胞溶血以抗氧化。方中取其清三焦之热以止血。连翘，性微寒而味苦，入肺、心、胆经。贾所学《药品化义》讲连翘总治三焦诸经之火。《本草正义》：“连翘，能散结而泄化络脉之热。”现代研究表明，连翘有明显的抗渗出作用及降低炎性病灶微血管壁脆性作用，从而发挥抗炎作用。方中取其清散上焦邪热，清血热，散血结、利水湿之功。生甘草，甘、平，归心、肺、脾、胃经。生用治痈疽疮疡等，解药毒及食物中毒。甘草次酸和甘草甜素有解热、抗炎作用；甘草浸膏和甘草次酸都有解毒作用。方中取其清热泻火解毒、调和诸药之力。可见金水清配伍严密，组方精练，共奏清热解毒，利湿止血之功，适于治疗早期实热的小儿血尿。
       
       血尿安是一种中药复方制剂,以肾茶、小蓟、白茅根、黄柏为主。其主要成分肾茶又称猫须草，主要化学成分为硫酸钙、未知有机酸的钙盐和钾盐、挥发油、皂苷、戊糖、己糖、葡萄糖。其性凉、味苦，具有利尿、止血、消肿的作用，在云南省西双版纳傣族自治州民间应用已数十年。该药中的其它成分如白茅根、小蓟、黄柏均为清热利湿、凉血止血之药，现代药理实验证实，它们均有明显的抗炎作用，可抑制和杀伤多种细菌、病毒，有利于清除体内抗原，减少免疫复合物的形成［6］。这与金水清治疗血尿湿热证机理相似，而西药如潘生丁、泼尼松等无此类似作用，故我们选血尿安为实验的阳性对照组用药。
       
       本研究结果显示，金水清可明显减少大鼠的尿红细胞，降低尿蛋白，同时降低IL-6的含量。已知IL-6是导致肾小球系膜细胞增殖的重要炎症介质，其既可由肾小球系膜细胞分泌，又可促进肾小球系膜细胞增殖。IL-6对维持机体生理平衡(免疫反应、炎症反应、急性期反应)具有重要作用。致炎物质刺激单核细胞可产生IL-1, IL-6及TNF-α，其中IL-6最为重要，是炎症反应的生化标志［7］。在脏器局部IL-6异常分泌往往导致一些免疫异常性疾病的发生。肾组织病理学观察可见，模型组光镜显示：肾小管上皮细胞肿胀变性，间质炎细胞浸润，是肾小管-间质损害的表现，各治疗组较模型组均有不同程度改善, 金水清早组效果尤为显著。
       
       综上可知，金水清可显著降低尿红细胞、尿蛋白的含量，从而改善临床症状，减轻肾脏损伤。同时可降低血清IL-6的含量，以早期减缓控制肾脏炎症，阻断病程进展，早期实现既病防变，将疾患扼杀于萌芽状态。另外，可抑制肾小球系膜增殖及细胞外基质的积聚，减轻肾小管-间质及肾小球和肾小管的损伤，是早期控制血尿,延缓肾病进展的有效方药，值得进一步研究和推广应用。
       【参考文献】
         　　［1］中华医学会儿科学会肾脏病学组.我国小儿肾小球疾病肾组织病理改变［J］.中华儿科杂志，1996,34(5):319.
       
       ［2］Piqueras AI, White RH, Raafat F, et al. Renal biopsy diagnosis in children presenting with haematuria. Pediatr Nephrol JT - Pediatric nephrology (Berlin, Germany),1998,12(5):386.
       
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       ［5］陈惠平，曾彩虹，胡伟新，等.10594例肾活检病理资料分析［J］.肾脏病与透析肾移植杂志,2000，9（6）：501.
       
       ［6］聂莉芳,王洪霞,李艳荣，等.益气滋肾口服液对IgA肾病患者尿白细胞介素-6的影响［J］.中国中西医结合杂志,2002,22(3):214.
       
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