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       【摘要】 
       目的观察升压宁对内毒素休克肝损伤大鼠肝组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的影响。方法采用一次性静脉注射内毒素（LPS）10 mg/kg复制内毒素休克模型，以升压宁预处理动物，并以地塞米松为阳性对照，免疫组化法测定肝组织中TNF-α和iNOS的表达。结果内毒素休克模型组存在严重肝损伤，肝组织中TNF-α和iNOS表达较空白对照组显著增强（P﹤0.01），升压宁组肝损伤较模型组减轻，TNF-α和iNOS的表达与模型组比较显著降低（P﹤0.01）。结论升压宁能减轻内毒素休克肝损伤，其机理与抑制TNF-α和iNOS的表达有关。
       【关键词】  升压宁； 内毒素休克； 肝损伤； 生脉散
       The Effect of Sheng Ya Ling on TNF-α and iNOS in Liver Injury Rats with Endotoxic Shock
       ZHENG Xiuli, FENG Quansheng, YANG Yu, ZHANG Qi, QIAO Weijuan
       Chengdu University of TCM，Chengdu  610075，China
       Abstract：ObjectiveTo explore the effect of Sheng Ya Ling on TNF-α and iNOS in liver injury rats with endotoxic shock.MethodsThe rats were injected intravenously LPS 10mg/kg to make endotoxic shock models. They were pre-treated by Sheng Ya Ling with the rats given dexamethasone as positive control group. Then observed the expression of TNF-a and iNOS were measured by immunohistochemical method.Results In the endotoxic shock model group, livers of rats were severely injured and the expression of TNF-α and iNOS in livers were increased more significantly than  that in the blank control group(P<0.01). The liver injury of Sheng Ya Ling group was slighter than that of model group and expression of TNF-α and iNOS were decreased more significantly than that of model group(P<0.01). ConclusionSheng Ya Ling can reduce liver injury by endotoxic and its mechanism may be with inhabitation of expression of TNF-α and iNOS.
       Key words：Sheng Ya Ling;   Endotoxic shock;   Liver injury;   Shengmaisan
        升压宁为长期从事感染性疾病研究的全国名老中医张之文教授之经验方，该方具有较好的升压、抗感染作用。温病学家叶天士提出“温邪上受，首先犯肺”，故前期实验从肺损伤入手进行研究，前期结果表明，升压宁能减轻内毒素休克肺损伤，其机理与抑制TNF-α和iNOS的表达有关［1］。
        现代研究认为，肝脏是机体清除内毒素的主要器官，是机体的主要“细胞因子产地和储库”［2］。因此，本实验采用内毒素所致感染性休克大鼠肝损伤模型，通过观察肝脏的组织形态学变化及测定肝组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一氧化氮合酶（iNOS）的表达，探讨升压宁对内毒素休克肝损伤的保护作用机制。
       1  材料与仪器
       1.1  动物健康SD雄性大鼠46只，体质量220～250 g，由四川省中药研究所提供。
       1.2  药物中药升压宁制成每毫升含1 g生药浓度，高温灭菌后4℃冰箱保存备用。阳性药地塞米松注射液，1    ml:5 mg/支，由西南药业股份有限公司生产。
       1.3  试剂与仪器
       内毒素（LPS，O55:B5，Sigma公司产品）；TNF-α试剂盒（北京莱博生物实验材料研究所）；iNOS试剂盒（美国Santa Cruz Biotechnology公司产品）。多导生理记录仪（日本光电），BL-420E+生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司），电热恒温培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司）。
       2  方法
       2.1   动物分组及处理 
       动物随机分为4组：空白对照组、休克模型组、升压宁组、阳性对照组。空白对照组10只，其余各组每组12只。处理如下：休克模型组（LPS组），将LPS经尾静脉按10 mg/kg一次性注入；升压宁组（LPS+SYN组），于造模前5天按成人等效剂量给予升压宁灌胃，10 g/kg，1次/d，连续5 d，并于造模（即注入LPS）10 min后，再十二指肠给予升压宁1次；阳性对照组（LPS+DSMS组），于术前10 min尾静脉注入地塞米松（2 mg/kg）葡萄糖溶液5 ml/kg。空白对照组，在各相同时间点注入等量生理盐水。
       2.2  动物模型制作 
       参照马超英［3］的造模方法，实验前打开BL-420E+生物机能实验系统。将SD大鼠用3％戊巴比妥钠溶液按0.15 ml/kg腹腔麻醉，仰卧固定于手术台，无菌操作下分离右侧颈总动脉，远心端用0号丝线结扎，近心端做一小切口插入肝素化硅胶管，0号丝线结扎固定以防滑脱，肝素化硅胶管另一端经压力传感器与BL-420E+生物机能实验系统端口相连记录血压。待动物血压、呼吸频率、心率平稳后（约15 min），除空白组外，其余各组均经尾静脉按10 mg/kg注入LPS，3 min缓慢推完，复制内毒素休克模型，空白组注入等量生理盐水。注入内毒素后，动态记录2 h内的血压变化。
       2.3  标本制备注入内毒素2 h后，股动脉放血处死动物，打开腹腔，用无菌手术剪剪取全肝，以4％多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋，切片（片厚3 μm或5 μm），其中取3 μm厚的组织片进行HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织形态学变化；取5 μm厚的组织片，进行免疫组化染色，检测肝组织中TNF-α和iNOS水平。
       3  结果
       3.1  各组大鼠一般状态比较见表1。表1  各组大鼠一般状态比较（略）
       3.2  肝组织病理形态观察
       3.2.1  肉眼观察空白对照组肝脏表面光滑，质地柔软；休克模型组肝脏表面光滑，被膜紧张，边缘钝圆，体积轻度肿大；各治疗组肝脏肉眼未见明显变化。
       3.2.2  光镜下观察肝组织HE染色后形态：空白对照组，肝细胞排列整齐，肝窦结构清楚。休克模型组肝细胞呈灶性坏死或弥漫性大片状坏死，肝窦结构被破坏，汇管区可见大量炎细胞浸润；各治疗组肝脏病理改变较休克模型组明显减轻，肝细胞见点状坏死，肝汇管区有少量炎细胞浸润。
       3.3  肝组织中TNF-α的变化 
       结果见表2。结果表明，与空白对照组比较，休克模型组的TNF-α阳性表达平均积分光密度和累积积分光密度均极显著增强（P﹤0.01）；与休克模型组比较，各治疗组经治疗后均能显著下调肝组织TNF-α的过度表达，其中生脉组与模型组比较差异显著（P﹤0.05），阳性组、升压宁组和小蓟组与模型组比较差异极其显著（P﹤0.01）；与阳性对照组比较，升压宁组、生脉组和小蓟组肝组织TNF-α的表达水平均无显著差异（P﹥0.05）；与升压宁组比较，生脉组和小蓟组TNF-α的表达水平均无显著差异（P﹥0.05）。表2  各组大鼠肝组织中TNF-α的变化（略）
       3.4  肝组织中iNOS的变化
       结果见表3。结果表明，与空白对照组比较，休克模型组的iNOS阳性表达平均积分光密度和累积积分光密度均显著增强（P﹤0.01），而阳性对照组和升压宁组的阳性表达iNOS平均积分光密度和累积积分光密度与空白组比较无显著差异（P﹥0.05）；与休克模型组比较，各治疗组经治疗后均能显著抑制肝组织iNOS的过度表达（P﹤0.01）；与阳性对照组比较，升压宁组、生脉组和小蓟组肝组织iNOS的表达水平均无显著差异（P﹥0.05）；与升压宁组比较，生脉组和小蓟组iNOS的表达水平均无显著差异（P﹥0.05）。表3  各组大鼠肝组织中TNF-α的变化（略）
       
       4  讨论
       4.1  对感染性休克的中医病机及治法的讨论 
       本研究从中医温病理论出发，结合感染性休克的发病机制与临床特点，认为感染性休克的病机主在“热、毒、瘀、脱”四字上。邪气入里，化火成毒，内陷营血，或热毒动血，毒瘀互结，出现皮肤花斑、紫绀；瘀毒加重，可致紫绀加重、DIC和多脏器功能衰竭，进一步发展可阴阳离决而亡。同时，热毒耗气伤津，津气两脱，故粘膜干燥、肢端缺血、血压低、尿少或无尿、表浅静脉萎陷；尤其是感染性休克中后期，津气耗竭欲脱。因此，治疗当益气敛阴固脱。同时，又由于毒瘀未尽，全身脉络广泛阻滞，使脏腑得不到精气濡养，脏腑衰竭。因而，在益气敛阴固脱的同时还应解毒化瘀，方能较好地控制感染性休克。
       4.2  对升压宁组方关键点的讨论  
       验方升压宁主要由红参、麦冬、五味子、小蓟组成。方中以生脉散益气敛阴固脱，加小蓟凉血化瘀解毒。
        对于生脉散中的人参，我们选用的是红参。人参由于加工方法的不同，可分为红参、生晒参、白（糖）参。其中红参具有较强的补气作用；生晒参作用较红参弱，除补气益气外，兼具生津作用，适于气阴两亏者；白参作用较红参、生晒参弱，适合气虚症状不明显者。可见，由白人参或生晒参组成的生脉散长于益气养阴敛阴，而回阳救逆作用较弱；而用红参则可增强本方回阳救逆的作用，加用麦冬、五味子益气养阴敛阴，使得阴阳兼顾、救阴回阳，即兼具益气养明、回阳救逆之功。药理研究显示［4］，红参的醇提取物对犬、兔、猫在离体心脏的作用与强心苷相似，可使其收缩增强，对其冠状动脉有扩张作用。人参加工成红参后，生成了一些具较强生理活性的新成分，而且某些成分间的含量也发生了变化，这是红参的某些药理作用的性质与强度同人参存在差别的物质基础和原因［5］。而且有研究专门对生脉散中红参与生晒参的药效进行了比较［6］，证实以红参组成的生脉散方，其抗心肌缺血，抗休克及提高耐缺氧能力的作用明显优于生晒参组方者。
        而方中为何选用小蓟？小蓟入药始见于《名医别录》，谓其“主养精保血”。《本草经疏》谓：“小蓟……主养精保血。精属阴气，血之所生也，甘温益血而除大热，故能养精而保血也。”《本草求原》谓：“小蓟则甘平胜，不甚苦，专以退热去烦，使火清而血归经，是保血在于凉血。夫凉血者多滞，而此则能行血；行血者无补，而此又能保血……”近代《医学衷中参西录》指出“小蓟根，善入血分，最清血分之热，……盖其性不但能凉血止血，亦能活血解毒……”。因此应用小蓟活血解毒，疏通瘀滞脉络，清解血分热毒，在与生脉散配合应用的前提下，使得津气恢复，气血得以灌注，脏腑气血功能趋于平衡，使阴平阳秘，则固而不脱。而且现代研究认为，小蓟具有升压、兴奋心肌、改善微循环、抗炎抑菌、镇静等作用［7，8］，这对控制感染性休克具有重要意义。本方主要取其升压作用，与生脉散的稳压作用结合，进而对感染性休克起到良好的升压稳压作用。选用小蓟本是从中医传统理论认识出发而运用，且又与现代药理作用吻合，是本方的一大特色之处。
       4.3  对实验结果的讨论TNF-α被公认为是在内毒素休克病程中最早释放且起关键作用的介质，是多种感染或内毒素休克早期产生的最重要的细胞因子［9］。本研究结果显示，LPS休克模型组大鼠肝组织中的TNF-α阳性表达显著增高，而升压宁组的TNF-α阳性表达水平最低，说明其具有抑制炎症介质TNF-α过度表达的作用，通过下调TNF-α表达而抑制由TNF-α介导的细胞因子炎症级联反应，进而减轻LPS介导的感染性休克对组织器官的损伤作用。
       
       iNOS是合成对细胞主要发挥细胞毒作用的高水平NO的关键酶，过量的NO是引起血管低反应性及严重低血压的原因［10］。iNOS在正常生理情况下不表达，而主要在各种炎症情况下表达，故又被称为炎性酶，LPS、TNF等均能诱导iNOS mRNA表达增加。本研究结果表明，休克模型组肝组织中的iNOS阳性表达水平较空白对照组显著升高，而升压宁组的iNOS阳性表达水平显著降低，说明其对iNOS的表达具有抑制作用。iNOS是合成对细胞主要发挥细胞毒作用的高水平NO的关键酶，升压宁通过对炎性酶iNOS表达的抑制，从而减少高水平的NO对细胞的细胞毒作用，及NO自由基对受感染机体的细胞及组织造成的损伤。
       【参考文献】
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