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       【摘要】 
       目的研究雷公藤多苷（GTW）对卵巢组织smad4 mRNA表达的影响以及菟丝子与黄精的干预作用。方法采用4周龄SD雌鼠，将实验大鼠据体质量随机分3组，分别为空白对照组、GTW组、干预组，连续灌胃12周后处死动物检测指标。结果GTW组卵巢次级卵泡数值最小，与空白组间差异有统计学意义（P＜0.05），与干预组间差异也有统计学意义（P＜0.01），空白组与干预组间差异没有统计学意义（P＞0.05）；黄体数比较各组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。GTW组smad4 mRNA表达与空白组间差异有统计学意义（P＜0.01），与干预组间差异也有统计学意义（P＜0.05）；空白组与干预组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。结论雌性幼鼠服用雷公藤多苷可造成卵巢组织病理改变，其中smad4 mRNA表达的下降可能是GTW导致雌性生殖损伤的关键点之一。中药菟丝子、黄精可以促进该过程的修复。
       【关键词】  雷公藤多苷； 幼鼠； 卵巢； 生殖损伤
       雷公藤多苷（glycosides of Tripterygium wilfordii Hook. F，GTW）是从植物雷公藤根芯部提取的一种有效组分［1］,因其可靠的疗效日益成为儿科肾脏疾病治疗中不可或缺的治疗药品之一。GTW的疗效是毋庸置疑的，但副作用也不容忽视，尤其是未成年人用该药是否会导致成年后的生殖损伤尚无定论。如何最大程度地发挥GTW的治疗效应同时最大限度地降低其副作用是当前儿科迫切需要面对的课题。为探讨解决这一问题的方法，本课题对GTW是否会影响卵巢组织smad4 mRNA的表达进行了研究，同期还研究了菟丝子黄精颗粒剂对此的干预作用。
       1  材料与仪器
       1.1  药物与试剂雷公藤多苷生药粉（GTW），江苏美通制药有限公司提供。菟丝子黄酮粉，西安昂盛生物技术有限公司提取。批号：20070914；规格：10％。原位杂交探针合成，天津灏洋科技生物技术有限公司；原位杂交试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂，Sigma公司产品。
       1.2 仪器VL-4S型超净台，珠海市再鑫仪器有限公司；RM2245石蜡切片机，德国莱卡；EG1150自动包埋机，德国莱卡； OLYMPUS-BX51,CH30显微镜，日本奥林巴斯公司产品；IMAGER-Pro Plus6.0彩色病理图像分析系统。
       1.3  动物清洁级雌性SD大鼠，4周龄，体质量（60±10）g，每组12只。购自河南省实验动物中心。饲养1周后无异常开始实验。
       2  方法
       2.1  分组及给药动物根据体质量随机分3组，分别为空白对照组（羧甲基纤维素钠CMC-Na）、阳性对照组（GTW）、干预组（菟丝子黄精颗粒剂组）。空白组予1%CMC-Na溶液；阳性组予9 mg/kg GTW混悬液（用CMC-Na溶液配制）；干预组予GTW混悬液加菟丝子黄精溶液（1 g/kg）。各组均连续灌胃12周后处死动物，检测指标。
       2.2  指标检测
       2.2.1  卵巢组织病理乙醚麻醉后取卵巢，放入当日配制的10％甲醛固定液中。常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，普通光镜下观察并图像分析。
       2.2.2  原位杂交法检测卵巢组织中smad4 mRNA表达探针序列：smad4 mRNA  5-TGCTG AAGAT GGCCG TTTTG GTGGT GAG-3。检测步骤：具体参照说明书进行。原位杂交检测结果判定：组织石蜡切片经原位杂交、DAB显色后，可在光镜下观察到mRNA阳性产物呈黄色或棕褐色颗粒。采用Imager-pro Plus 6.0图像分析系统分析阳性细胞表达强弱，测试各级卵泡中卵母细胞、颗粒细胞以及卵泡膜细胞中染色阳性细胞的灰度值。每组检测不少于6张切片。
       2.3  统计学方法实验数据用SPSS 14.0软件包分析。统计学处理结果以±s表示，样本数据比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
       3  结果
       3.1  卵巢组织smad4 mRNA表达
       结果见表1。表1  菟丝子黄精与雷公藤多苷用药后卵巢组织smad4 mRNA表达统计(略)
       3.2  卵巢组织病理改变空白组卵巢体积较大，卵泡生长活跃，卵泡形态、数量正常。颗粒细胞层次多，排列整齐，卵泡液含量多。黄体发育好。雷公藤多苷组各级卵泡数量减少，部分成熟卵泡颗粒细胞层次减少，排列紊乱、疏松。菟丝子黄精组各级卵泡数量多，生长活跃，成熟卵泡多，体积大，颗粒细胞排列整齐。闭锁卵泡较少。黄体发育良好。
       
       卵巢次级卵泡数结果：空白组与GTW组间差异有统计学意义（P＜0.05），与干预组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。GTW组与其他两组间差异（P＜0.05）。卵巢黄体数比较各组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。见表2。表2  用药后各组卵巢组织次级卵泡数与黄体数统计表(略)
       4 讨论
        雷公藤，味苦、辛，性凉，归肝、肾经，有大毒，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒等功效。雷公藤多苷是雷公藤的提取物，在儿科主要用于治疗各种原发性和继发性肾炎，尤其多用于小儿过敏性紫癜性肾炎的治疗。不正确使用雷公藤多苷可造成肾藏精气的损耗。安全有效地使用GTW在儿科肾病临床具有重要意义。中医认为由雷公藤多苷引起的女子月经紊乱甚至不孕病机是肾虚冲任不固，而动物实验也证实补肾中药可以有效防治GTW的生殖损伤作用［2～7］。
        哺乳类动物卵巢中卵泡的发生是相当精细、复杂的过程。生殖器官组织结构的病理改变能直接影响生殖功能。本实验结果显示GTW组卵巢中的次级卵泡数、黄体数测值最小，提示GTW可导致卵巢的组织病理病变，而菟丝子黄精对该损伤具有保护效应。肾的阴阳失调，往往是肾虚的核心问题，调整肾的阴阳是提高补肾疗效的关键［8］。菟丝子始载于《神农本草经》，味辛、甘，性平，归肝肾经，现代中医临床多用其治疗卵巢早衰、多囊卵巢综合症、月经不调、闭经、不孕等妇科疾病［9，10］。黄精，味甘，性平，归脾肺肾经，有宽中益气，益肾填精，滋阴润肺，生津补脾之功效，现代药理研究表明，黄精具有增强免疫，降低血脂、血糖，抗炎、抗病毒、抗真菌和抑制脂质过氧化、延缓衰老等多种药理作用［11，12］。菟丝子偏补阳，黄精偏补阴。二者一阴一阳，刚柔相济，调整阴阳平衡，可共奏“滋化源，奉生气”功效。
        目前国内、外研究的共识是卵泡发育过程是由许多生长因子组成的分子网络共同调控发生的，其中TGF-β家族发挥着关键的调控作用［13］，而smad蛋白作为TGF-β受体的底物在其中发挥着重要的作用［14］。同时Smad4因为是Smads基因家族中的共同中介分子，在TGF-β信号转导中的作用尤为重要 。TGF-β通过Smad4途径以局部内调控方式参与卵泡的发育，促进卵母细胞的成熟、颗粒细胞的增殖与分化、卵泡的募集以及优势卵泡的形成和排卵等过程，同时也是卵巢产生类固醇激素，调节机体发育等的基础。本实验原位杂交结果显示GTW组卵巢组织中Smad4 mRNA表达测值明显低于空白组和干预组，提示GTW抑制了Smad4 mRNA的表达。这可以导致卵巢细胞的分化、成熟过程受到阻碍。推测雌性幼鼠服用雷公藤多苷造成卵巢组织病理改变，其中smad4 mRNA表达的下降可能是损伤途径之一。干预组的Smad4 mRNA表达较GTW组高，说明菟丝子、黄精可以促进被GTW所抑制的Smad4 mRNA表达。
       【参考文献】
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