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       【关键词】  白屈菜红碱；,,细胞凋亡
       摘要：笔者回顾了10多年来白屈菜红碱诱导细胞凋亡的细胞和分子机理的研究，总结这些机制包括白屈菜红碱对BclXL（Bcl2家族的抗凋亡成员）和PKC的复杂作用，促进Cytc的释放和ROS的产生以及对微管蛋白的抑制作用；同时简要地介绍了相关的实验。
       关键词：白屈菜红碱；  细胞凋亡
       Review on the Mechanism of Apoptosis Induced by Chelerythrine
       ZONG Yongli，LIU Yanping*
       (College of Biological Science and Technology, Zhongnan University, Changsha, Hunan 410013, China)
       Abstract：This article reviews recent ten years" investigations in the molecular and cellular mechanisms of actions by which chelerythrine induces cells apoptosis, summarizes the mechanisms including complex functions of chelerythrine on BclXL (an antiapoptosis member of Bcl2 family) and PKC, promotions CytC release and ROS generation and inhibition on tubulin polymerization. It also briefly introduces the relative tests. 
       Key words：Chelerythrine；  Cells apoptosis
   
　　白屈菜红碱属于苯并菲啶类碱，其氯化物分子分子式是 C21H18NO4Cl，分子量是383.84，能溶解于水和DMSO。对它的药理作用的研究由来已久。Steven 等［1~7］在体外实验中证实白屈菜红碱对9种肿瘤细胞(HT29，MCF7，MCF7ADR，DaOY，SQ20B，SCC61，JSQ3，SCC35，LnCaP)表现细胞毒性。细胞通过不同浓度的白屈菜红碱处理在37°C下孵育4 h，其ED50的范围是2~5 μm［8］。对化学和放射耐受的肿瘤细胞株包括SQ20B， JSQ3，SCC35（都是p53突变型）和对放射敏感的SCC61表现了与其它相同的剂量-效应曲线。值得好奇的是在对SQ20B细胞产生相同的作用时，白屈菜红碱和顺铂的药物剂量相当［9~10］。在体内，对SQ20B大鼠移植HNSCC肿瘤模型导致肿瘤生长抑制，接受药物处理组大鼠<10%的体重的降低和白屈菜红碱表现微小的全身毒性提示它可能是一个有用的抗肿瘤剂。众所周知，抗肿瘤作用的最重要的机制之一是凋亡的诱导，但是在国内的资料中很少见到这方面的报道。本文回顾了近10多年来白屈菜红碱诱导细胞凋亡的细胞和分子机理的研究。
       　　1  白屈菜红碱和Bcl2家族
       1.1  白屈菜红碱抑制BclXLBH3的相互作用已经证明BAK 和 BAD蛋白的BH3 区 必须结合到BclXL才能发挥它们促凋亡的作用［11~13］，进一步证明BAKBH3缩氨酸单独就有诱导多种细胞凋亡的作用［14~17］，暗示促凋亡蛋白的BH3 区和Bclχl的相互作用在促凋亡信号的调节中具有重要意义，因此能够抑制 BclXLBH3 区相互作用的的小分子化合物能够潜在地充当凋亡调节器。基于FP（Fluorescence Polarization荧光偏振）技术设计一个高通量的筛子旨在鉴别能够阻断BclXL和BAK的BH3区相互作用的化合物［18］，总共107 423种来自于植物、放射菌类真菌类、海洋无脊椎动物、海声细菌的提取物被筛选［19］， 其中12种提取物被选取用来分离活性成分，而发现4种植物提取物的有效成分都是白屈菜红碱，白屈菜红碱在IC50 1.5 μM置换了重组体GSTBcLXL融合蛋白中荧光标记的BH3 区缩氨酸［19］，证明白屈菜红碱是BclXLBH3的相互作用的抑制剂。
       1.2  白屈菜红碱阻止了BclXL 和BAX之间的相互结合 BclXL与BAX的结合是BclXL发挥作用的前提，而当BAX在细胞内超表达，并形成同源二聚体时，细胞对死亡信号的反应增强。所以BCL2与BAX的比例，即BCL2/BAX异源二聚体与BAX/BAX同源二聚体的比例，决定了细胞对凋亡信号的反应。白屈菜红碱能够阻止 BAX与Bcl2的结合，白屈菜红碱对BAX和 BclXL的作用是特效的，有趣的是白阻止 BAX对Bcl2的结合呈剂量依赖性［19~25］。
       1.3  白屈菜红碱诱导BclXL过表达细胞SHSY5Y Cells凋亡过表达Bcl2 或者 BclXL能够阻止细胞多种形式的细胞死亡诱导刺激, 例如放射和很多生化药物［26,27］，限制浓度的内生因子所提供的先于线粒体步骤的凋亡信号途径能够被BclXL过表达所阻止［19］另一方面，如果一种化合物能够直接作用于BclXL,它就应该能轻易地克服这种蛋白的作用，因为细胞蛋白的浓度，即使在过表达的情况下相对于可以获取的小分子化合物也是有限的。为了验证这个假设，Mark 等人制作了过表达BclXL的SHSY5Y细胞。在这种细胞里BclXL的水平大大地被提高，然而其它的Bcl2家族成员例如BAX, BAK, 和 BID相对保持在一个稳定的适度下调的B水平。在2μmol/L以下的低浓度，过表达的BclXL能够产生对白屈菜红碱杀伤作用的抵抗。在高浓度（2 μmol/L以上），白屈菜红碱越过BclXL的保护作用而诱导这种细胞凋亡［19］。这个数据显示白屈菜红碱诱导凋亡是直接抑制 BclXL/Bcl2。当前验证的 BclXLBH3相互作用的抑制剂本质上都是促凋亡剂。在延误肿瘤生长的实验中，证明白屈菜红碱是一种相对毒性较小的抗肿瘤试剂［28］ 。值得一提的是，Mark 等在做这个实验的时候，还同时发现在一定的条件下尽管鬼臼亚乙苷处理的BclXL过表达细胞没有经历凋亡，却被各自阻止在 G2 和 S 期，这个发现与当时的报道一致暗示出具遗传毒性的药物诱导的细胞周期阻止不受BclXL过表达的影响［29~31］。
       　　2  白屈菜红碱处理的SHSY5Y细胞出现亚G1期 DNA的和线粒体膜电位的降低Victor 等［32,33］
       用2.5 μmol/L和 5 μmol/L浓度白屈菜红碱作用的 SHSY5Y细胞诱导出一个实质性的线粒体膜电位的降低［19］，这个可通过JC1绿色荧光的增加显现出来。白屈菜红碱诱导线粒体膜电位的变化，部分地被广谱的caspase 抑制剂ZVAD抑制。相似的报道表明BAX诱导的线立体膜电位的变化对caspase的抑制敏感［34,35］ 。白屈菜红碱处理的SHSY5Y细胞导致亚G1期 DNA的出现预示凋亡，亚G1期 DNA的出现总体上被ZVAD阻止，这种白屈菜红碱作用后线粒体膜电位的变化和亚G1期 DNA出现在其它的两种细胞也能看到：一个克隆癌细胞株HCT116和一个乳癌细胞株MCF7，表明这种作用不局限在SHSY5Y细胞［19］ 。
       3  白屈菜红碱引起线粒体细胞色素C(Cytc)的释放
       许多死亡的刺激引起凋亡是通过线粒体的膜间间隙释放细胞色素C从而激活Apaf1（apoptosis protease activating factor1 凋亡蛋白酶激活因子）。二者一起形成凋亡诱导复合物（Apoptosome Complex），进而激活caspase9，引起细胞的凋亡 ，然而如果白屈菜红碱是作用在线粒体的BclXL 或 Bcl2，它应该能够引起Cytc从分离的线粒体里直接释放如同从促凋亡的Bcl2家族成员所观察到的［36~39］ 。为了研究这个Antony 等［19］ 把线粒体从健康的SHSY5Y细胞株分离出来，然后给予各种死亡的刺激，结果白屈菜红碱从线粒体释放出Cytc并且呈剂量依赖的特征。鬼臼亚乙苷和其他的蛋白激酶C抑制剂例如H7和星行孢菌素即使在超过了凋亡诱导所要求的浓度也不能产生这样的作用。有可能Cytc的释放对于白屈菜红碱对BclXL/Bcl2 的功能表现一个直接对抗的作用。
       　4  白屈菜红碱对PKC作用
       蛋白激酶（protein kinase C，简称PKC）是一种Ca2+磷脂依赖，需二乙酰甘油活化的激酶。现已证实它在多种生物活性物质调节细胞生长和增殖反应的信号传导过程中起重要作用，且因其为佛波酯类促癌物的主要作用受体或靶点而愈来愈引起人们的重视。关于PKC与凋亡的关系的研究目前还不是很明确，有些研究发现PKC可通过拓扑异构酶Ⅱ的磷酸化而直接作用DNA，导致DNA损伤和细胞凋亡，而白屈菜红碱通过PKC诱导凋亡的具体的机制也不是很清楚。有研究认为白屈菜红碱抑制PKC诱导凋亡是通过激活一种不确定的神经磷脂酶，导致神经酰胺的堆积和神经鞘磷脂的去除，即通过激活神经酰胺信号瀑布［40，41］。白屈菜红碱对PCK的抑制作用呈剂量依赖性，它的抑制作用是通过与PKC催化区的直接结合。白屈菜红碱竞争PKC的保守催化位点。与 H7和 星行孢菌素不同，白屈菜红碱在诱导凋亡的剂量不抑制其它的激酶 也不激活磷脂酶D［42~44］，白屈菜红碱是最特效的PKC抑制剂之一。和星行孢菌素相比，白屈菜红碱对PKC的选择性比对其它的激酶（如PKA, PKG）要高100倍。白屈菜红碱对PKC的这种特异性促进了用它对细胞中PKC的功能的研究。Ralph 等［8］证明白屈菜红碱对PKC活性的抑制的方法是：细胞用逐渐增加的白屈菜红碱处理，溶解，通过来自于神经纤维角质蛋白的缩胺酸来化验PKC磷酸转移酶的活性.反应在磷脂酰丝胺酸和 Ca2+存在的情况下进行以保证PKC A组和B组的活性。加白屈菜红碱30 min（体外实验发现生长受到抑制的最短时间），PKC的活性降低呈现剂量依赖的特征。 在白屈菜红碱的浓度为10μmol/L时，PKC磷酸转移酶的活性消失，非放射性的蛋白激酶化验试剂盒也能够用来证实这个结果。有些研究认为白屈菜红碱对PKC的抑制活性是不能确定的。John 等［45］在广泛系列的各种哺乳动物的不同的PKC同工酶的研究中发现白屈菜红碱对PKC没有很有力的抑制活性，白屈菜红碱在浓度达到40 μg/ml时不能抑制3H标记的佛波醇12，13丁酸盐结合到PKC的调节域，在培养的人类白血病HL-60细胞没发现PKCα , β, 或 γ明显的转位变化。白屈菜红碱这种对PKC缺少抑制活性的现象在多种式样中发现，无论有没有催化剂（PDBu 或 二油精）的存在。实际上，相反，当用大、小鼠胞质片段进行分析时，发现白屈菜红碱提高了PKC的活性。这个反应活性与Lombardini证实的白屈菜红碱刺激了小鼠视网膜线粒体片段上一个20kDa的蛋白的磷酸化相一致［46，47］。而且，在未经处理的细胞，Gopalakrishna等［48］发现白屈菜红碱和血根碱能够诱导胞液中膜迁移的初始活化作用，随后下调PKC.这个反应平行于促肿瘤物质如佛波酯，但不是PKC抑制剂。沿着这个思路John 等［49］研究angoline和白屈菜红碱在HL60细胞中促进PKCα , β, 和 γ的置换的作用，但是没有发现明显的变化 。但他们承认白屈菜红碱能够抑制7,12二甲基苯蒽诱导的大约60%肿瘤前损害。根据Herbert等［49］的报道，这种效果部分是由于PKC的抑制，所以John 等建议：在对白屈菜红碱及其相关复合物的生物学作用的探索时，不依赖PKC的作用途径应当考虑在内，而应当从广泛地涉及白屈菜红碱功能的作用机理来说明。无论怎样，PKC抑制剂已经参与肿瘤的临床治疗研究，作为白屈菜红碱的类似物 NK109在日本已经进入II期实验，而白屈菜红碱的另一个类似物UCN01也是PKC抑制剂在美国进入I期实验［8］ 。
       　　5  白屈菜红碱通过产生活性氧快速诱导细胞凋亡
       ROS （reactive oxygen species活性氧）引起细胞凋亡的机理可能包括∶1）ROS导致DNA损伤，诱导细胞调亡［50］ ；2）ROS活化NFKB并使其表达导致凋亡［51］；3）ROS激活SAPK通路介导细胞调亡。活性氧在诱导肿瘤细胞凋亡的作用是得到肯定的。Yamamoto 等［52］在实验中发现白屈菜红碱通过产生活性氧快速诱导心肌细胞凋亡。白屈菜红碱快速诱导心肌细胞萎缩固缩和随后死亡。白屈菜红碱诱导细胞死亡伴随核断裂和caspase3 及 9的激活，同时又被XLAP（凋亡抑制基因）所阻滞，这表明细胞死亡是由于细胞凋亡引起的。高浓度的白屈菜红碱导致细胞坏死，没有观察到细胞的萎缩和caspase的激活。静脉注射白屈菜红碱（5 mg/kg）于成年小鼠心肌细胞也能增加凋亡。下调对佛波醇12烷酯13醋酸盐（phorbol 12myristate 13acetate  PMA）敏感的PKC不能影响白屈菜红碱诱导的凋亡，但是抗氧化剂包括N乙酰基半胱氨酸（Nacetylcysteine  NAC）、谷胱甘肽能抑制它的诱导凋亡的作用。提示是活性氧而不是对PMA敏感的PKC导致了白屈菜红碱诱导的心肌细胞的凋亡。Matsunaga 等［53］认为神经酰胺能够刺激活性氧的产生，导致线粒体氧化损伤，引发凋亡。如果白屈菜红碱抑制PKC是通过激活神经酰胺信号瀑布［40，41］，导致神经酰胺积累，后者刺激活性氧的产生，再引发凋亡。
       　6  其他
       白屈菜红碱抑制微管蛋白的聚合（影响有丝分裂和其它微管有关的功能）。白屈菜红碱能够抑制紫衫醇介导的小鼠脑微管蛋白的聚合［54］，阻止细胞有丝分裂的进行，同时促使细胞凋亡。白屈菜红碱在Ca2+信号传导方面的研究我们实验室还在进行。总之，已经研究证明白屈菜红碱在诱导细胞凋亡的作用机制是多方面的，涵概了凋亡诱导的大部分途径，白屈菜红碱是一种很有开发前景的细胞凋亡诱导剂。
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       (中南大学生物科学与技术学院，湖南 长沙  410013)