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       【摘要】 
       目的观察川芎嗪（TMP）对糖尿病肾病（DN）大鼠肾间质巨噬细胞浸润及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表达的影响。方法选用SD大鼠，采用单侧肾切除链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病肾病大鼠动物模型。成模后随机分为5 组，每组12只，分别为模型组，空白对照组，贝那普利（Lotensin）组，川芎嗪高、低剂量组。除空白组和模型组外，其余各组按组别，每只分别予贝那普利1.7 mg/（kg·d）、川芎嗪150，50 mg/（kg·d）灌胃，共12周。实验第4周、第8周和第12周，测定24 h尿蛋白定量；治疗12周后，免疫组化检测肾间质巨噬细胞（ED-1）表达，RT-PCR方法测定肾间质MCP-1、ICAM-1 mRNA表达。结果与空白对照组比较，模型组大鼠24 h尿蛋白定量明显升高 (P＜0.05)，肾小管间质中ED-1明显增加（P＜0.01），肾间质MCP-1、ICAM-1 mRNA表达明显上升（P＜0.01）。川芎嗪高剂量组大鼠24 h尿蛋白定量明显降低，肾小管间质组织ED-1表达减少，MCP-1、ICAM-1mRNA表达明显下调，与模型组比较均有显著性差异（P＜0.05)。结论川芎嗪能减轻DN大鼠肾小管间质巨噬细胞浸润，其机制可能与减少MCP-1、ICAM-1表达有关。
       【关键词】  川芎嗪； 糖尿病肾病； 单核细胞趋化蛋白-1； 细胞间粘附分子-1
       Effect of Ligustrazine on Macrophages Infiltration and Expression of MCP-1 mRNA and ICAM-1 mRNA in Renal Interstitium of Diabetic Nephrosisi Rats
       YANG Yan,XIE Chunguang
       （Chengdu University of TCM,Chengdu,610075 China）
       Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Ligustrazine on macrophages infiltration and expression of MCP-1 mRNA and ICAM-1 mRNA in renal interstitium of diabetic nephrosis (DN) .MethodsDiabetes was induced by injecting streptozotocin after uninephrectomy.60 rats were randomly divided into 5 groups:model control group,normal control group,Lotensin group(1.7 mg·kg-1·d-1),high dose of TMP (150 mg·kg-1·d-1) and low dose of TMP(50 mg·kg-1·d-1).Immunohistochemical method was used to examine the expression of ED-1.The expressions of MCP-1mRNA and ICAM-1mRNA were detected by the method of RT-PCR. Results24 h urine protein was increased singificantly in model control group as compared with normal control group(P＜0.05),and the expression of ED-1 was (P＜0.01) increased.The expression of MCP-1 mRNA in high and low-dose ligustrazine groups was decreased remarkably(P＜0.01 or P＜0.05).High and low-dose ligustrazine groups could inhibit the expression of ICAM-1mRNA(P＜0.05).24-hour urine protein was lower in high dose of TMP than those in model control group(P＜0.05).ConclusionTMP can reduce macrophages infiltration,and its possible mechanisms may be related to inhibition of MCP-1 and ICAM-1 expression.
       Key words：TMP;  Diabetic nephropathy;  Tubulointerstitium;  MCP-1;  ICAM-1
       
       糖尿病肾病（DN）是终末期肾衰竭的主要原因之一。肾小管间质病变是糖尿病肾病的主要特征之一，并且是糖尿病肾病所致肾功能不全的重要预测因子。因此，更多的关注DN小管间质病变具有非常重要的临床意义。有研究证实巨噬细胞在肾小管间质病变的发生发展中占据重要地位［1］。川芎嗪是从中药川芎根茎中提取分离的生物碱单体，药理作用广泛。本研究即采用单肾切除链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病肾病模型，观察川芎嗪对其肾小管间质巨噬细胞浸润及对MCP-1、ICAM-1 mRNA表达的影响，为其防治DN小管间质损害提供理论依据。
       1      材料与方法
       1.1    动物60只雄性清洁级Wistar大鼠（成都中医药大学实验动物中心提供），体重200～220 g。所有大鼠置于空气流通，温度18～25℃，湿度40%～70%的环境中，给予12 h光照，自由进食、饮水。标准化饲养房笼子驯化喂养1周，实验前禁食1 d。
       1.2    药品与试剂  盐酸川芎嗪片（50 ｍg/ 片）由北京市燕京制药厂生产(批准文号：国药准字H11021964)；贝那普利由北京诺华制药有限公司生产（批准文号：国药准字H20030514）；STZ购自Sigma公司；鼠抗人ED-1单克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司；TRIZOL RNA提取试剂盒（美国Gibco公司，B2101）；Taq DNA聚合酶（美国MBI公司，CE701-7）；RNA逆转录试剂盒（美国MBI公司，CE512-1）。
       1.3    动物模型及分组 
       1.3.1  糖尿病肾病模型的建立  将60只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40  mg/kg（0.4 ml/100 g）麻醉后，常规消毒，从距右脊肋骨1.5 cm处斜向外方切口，于腹膜外暴露肾脏并剥离肾脏周围的脂肪组织，行右侧肾脏切除术。整个手术过程遵循无菌操作原则。术后2周，将其随机分为两组：空白对照组（n=12）和糖尿病造模组（n=48）。糖尿病造模组（n=48）于禁食12 h后一次性腹腔注射STZ（纯度99.7%），临用前将STZ溶于0.1 mol/L，pH 4.2的无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中，终浓度为1%（冰浴中新鲜配制，随配随用），按60 mg/kg体重的剂量进行单次腹腔内注射，72 h后，尾静脉采血，测空腹血糖浓度＞16.7 mmol/L，尿糖阳性（与正常组比较），确定造模成功。  
       1.3.2  分组及治疗  将造模成功糖尿病造模组48 只大鼠随机分为4 组：模型组（n=12）；贝那普利对照组（n=12）；川芎嗪低剂量组（n=12）；川芎嗪高剂量组（n=12）；另加前述空白对照组12只，共5组动物。除模型组外，其余各组按组别每只分别予以贝那普利1.7mg/（kg·d），川芎嗪50，150mg/（kg·d），生理盐水灌胃2 ml，共12周。
       1.4     观察指标及方法
       1.4.1    24 h尿蛋白定量测定   于造模第4，8，12周各检测1次尿蛋白定量。
       1.4.2    肾间质ED-1表达  采用免疫组化方法：肾组织常规脱蜡水化，3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶；用微波暴露抗原，封闭内源性生物素；滴加1：10正常兔血清，10%小牛血清蛋白室温下孵育2 h，封闭非特异性抗原。分别滴加兔抗大鼠ED-1单克隆抗体（1∶200），4℃过夜。滴加生物素化二抗IgG（1∶200），37℃ 40 min；洗涤后室温下滴加DAB显色液，镜下控制显色时间。苏木素复染、1%盐酸酒精分化。常规脱水、透明、封片。实验均采用删除第一抗体作内阴性对照。在光镜400倍视野下，随机采集肾皮质图像，共10个视野，用Lecia图像分析系统进行分析。以上选取的肾皮质均不含肾小球及较大小动脉。
       1.4.3    肾小管间质组织MCP-1、ICAM-1 mRNA的表达  采用RT-PCR方法：总mRNA提取按TRIZOL说明书进行，测定RNA浓度后，取0.5 μg总RNA逆转录为cDNA，引物：ICAM-1上游5" -CACAGGTGGTGCTI"CTGAAC-3"，下游 5" -CTCCTGAGCCTTCTGTAACTTG-3"，540bp，MCP-I 上游 5" -GGTGTCCCAAAGAAGCTGTAG-3"，下游 5"-TCTCTGTCATACTGGTCACTTC-3"，270bp，GAPDH 上游 5" -AAGAACAGGCTCTTAGCA-3"，下游 5" -CCAGTAGACTCCACGACAT-3"，200bp。PCR反应条件：94℃预变性，2 min，94℃变性30 s，72℃退火1 min，72℃延伸10 min，经35个循环。PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，Bio- Rad Quantity one 4.4.0图像分析系统进行分析。结果用各基因扩增条带光密度值与内参照GAPDH光密度值的比值表示。
       1.4.4   统计学处理  结果用±s表示，组间差异采用方差分析、t检验，由SPSS for Windows 10.0 统计软件完成。
       2   结果
       2.1    川芎嗪对各组大鼠24h尿蛋白定量的影响  与空白对照组比较，造模后第4周、第8周、第12周模型组尿蛋白明显升高(P＜0.05)；与模型组比较，各治疗组尿蛋白定量均有下降(P＜0.05，P＜0.01)；与贝那普利对照组相比，在第12周，川芎嗪高、低剂量组有显著性差异(P＜0.05）。与模型组比较，尽管随着时间的延长，各治疗组尿蛋白不断上升，但在第8周和第12周尿蛋白定量水平均呈下降趋势。结果见表1。
       表1  治疗后12周各组大鼠24h尿蛋白定量比较（略） 
       与空白对照组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与西药组比较，▲P＜0.05
       2.2     ED-1在肾间质中的表达  大鼠在造模后肾间质组织ED-1表达明显增加，与空白对照组比较具有显著性差异（P＜0.01）；与模型组比较，各药物治疗组大鼠肾间质组织ED-1表达均明显减少（P＜0.05）；与贝那普利组比较，川芎嗪各组无明显差异性（P＞0.05）。结果见表2。
       2  .3  对肾小管间质MCP-1 、ICAM-1 mRNA表达的影响  与空白对照组比较，模型组和各治疗量组MCP-1、ICAM-1 mRNA均显著增高，有统计学意义（P<0.01或P<0.05) 。治疗各组与模型组比较均明显降低，其中贝那普利组和川芎嗪低剂组、高剂组与模型组比较均有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。结果见表3。
       表2  ED-1阳性物质在肾小管间质表达（略） 
       与空白对照组比较，▲P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05
       表3  肾小管间质MCP-1、ICAM-1mRNA的表达（略） 
       与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05；与贝那普利组比较，#P<0.05
       3     讨论
       
       肾小球和肾小管肥大是DN的主要病理表现，而肾间质损害更是DN进展为肾衰竭的主要因素。目前普遍认为肾间质炎症在其中发挥主要作用，而巨噬细胞浸润是肾脏小管间质病变中的重要病理特征。研究发现，巨噬细胞通过上调MHCⅡ类抗原的表达以及合成、分泌炎性介质如TNF-α、白介素-1β(IL-1β)，活化肾脏固有细胞及T淋巴细胞，使骨调素分泌增加，黏附分子表达上调,从而吸引并趋化更多的炎性效应细胞局部聚集和活化，级联放大炎症反应过程［2］。它们还可以诱导巨噬细胞表达多种细胞因子,如IL-6、TNF-α、单核细胞化学趋化蛋白-1(MCP-1)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)等。这些后续因子通过招募球周成纤维细胞进入鲍曼囊参与组织纤维化及新月体形成［3］。同时巨噬细胞可产生活性氧自由基、一氧化氮(NO)、TNF-α、非特异性酯酶等导致细胞毒效应，并且可通过合成、分泌转化生长因子-β（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）等生长因子促进肾脏固有细胞增生、肾小球硬化及间质纤维化。另外，巨噬细胞还可释放基质降解蛋白酶抑制物，如金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)和纤溶酶原激活物抑制物或血浆酶原活化抑制因子-1(PAI-1)，减少细胞外基质（ECM）降解,促进ECM的积聚，甚至直接分泌ECM成分如胶原Ｉ、纤维连结素、硫酸软骨素等,参与间质纤维化的形成。可见巨噬细胞浸润是糖尿病肾病炎症的特征性表现之一，也是糖尿病肾病发生发展的中心环节。
       
       MCP-1的主要功能是趋化和激活单核细胞至炎症部位，与单核细胞上的MCP-1受体高亲和力结合，使巨噬细胞迁移并活化。长期的高血糖是DN发生的一个基本因素，高血糖能刺激多种细胞合成和分泌MCP-1。Ihm等［4］应用酶联免疫吸附测定和反转录聚合酶链反应技术研究了在高糖浓度下MCP-1在肾组织的表达，发现高糖可以直接刺激肾组织中MCP-1蛋白的产生，认为这可能是DN时肾组织中单核细胞浸润的重要原因。MCP-1对单核细胞／巨噬细胞有很强的特异性趋化作用，直接参与单核细胞／巨噬细胞的浸润。ICAM-1为免疫球蛋白超家族(IgSF)的主要代表，通常以低水平表达于血管内皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小管周围毛细血管内皮细胞及某些肾小球囊的壁层上皮细胞，也表达于间质细胞。研究发现MCP-1可上调巨噬细胞膜表面粘附分子CD11／CD18的表达，使巨噬细胞粘附性增强。ICAM-1主要通过与其配体如淋巴细胞功能相关抗原(LFA一1)等结合，介导细胞与细胞(主要是白细胞与血管内皮细胞)、细胞与细胞外基质、基质细胞之间的粘附。在正常组织结构和功能的维持、炎症及免疫应答等多种生理、病理过程中起主要作用。当受到炎性因子如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-a)等刺激后，ICAM-1表达上调，ICAM-1的持续增强表达可导致组织器官结构和功能的严重损伤。Hikaru等［5］发现链脲佐菌素(STZ)鼠肾小球在糖尿病早期即有ICAM-1mRNA表达，伴随单核细胞浸润；Aoyama等［6］发现小管上皮细胞亦强表达。
       
       川芎嗪具有改善微循环、抗纤维化和拮抗钙离子等药理作用，已广泛应用于心、脑、肺、肾及血管疾病的治疗，大量临床及动物实验证明TMP对DN有很好的疗效, 已有研究证实它还具有抗炎作用，能够抑制组胺、5-羟色胺的合成、释放，且在急性冠状动脉综合征中具有抗炎作用［7，8］。本研究发现，在DN大鼠造模后第4周即出现大量蛋白尿，肾小管间质MCP-1、ICAM-1mRNA表达明显增加，而川芎嗪可以显著减少蛋白尿，抑制ED-1在肾小管间质表达，下调MCP-1、ICAM-1mRNA表达。由于ICAM-1主要介导单核巨噬细胞浸润与激活过程，其上游主要信号转导途径为PKC-NF-κB途径。因此川芎嗪可能是通过抑制PKC的激活，降低NF-κB的活性, 从而使ICAM-1的转录活性被抑制，使其表达下调，减少肾小管间质的单核巨噬细胞浸润，减轻炎症过程，实现了对DN肾小管间质损害的保护作用。
       【参考文献】
         　　［1］ 贾汝汉, 高 苹. 糖尿病肾病肾小管间质病变研究进展［J］.中国中西医结合肾病杂志，2005，6（6）：311.
       
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       ［3］ Atkins RC, Nikolic Paterson DJ, Song Q, et al. Modulators of crescentic glomerlulo nephritis［J］. J Am Soc Nephrol, 1996,7:2271.
       
       ［4］ Ihm C G，Park J K，Hong S P，et a1．A high glucose concentration stimulates the expression of monocyte chemotactic peptide 1 in human mesangial cells［J］．Nephron，1998，79：33.
       
       ［5］ Hikaru S，Kenichi S,Kyoji H，et a1．Increased expression 0f intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)in diabetic rat glomerular hyperfiltration is a potential mechanism of ICAM -1 upregulation［J］．Diabetes,1997,46(12)：2075.
       
       ［6］ Aoyama I，Shimokata K,Niwa T，et a1．An oral adsorbent downregulates renal expression of genes that promote interstitial inflammation and fibrosis in diabetic rats［J］．Nephron，2OO2，92(3)：635.
       
       ［7］ 范治云，罗 红，刘玉兰，等. 川芎嗪的抗炎作用与组胺、5-羟色胺的关系［J］.中药新药与临床药理，2004，2：22.
       
       ［8］ 吴海云，王士雯，朱 姝，等. 川芎嗪在急性冠状动脉综合征中抗炎作用的研究［J］. 中国中西医结合急救杂志，2004，4：15.