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       【摘要】 
       目的建立复方天麻颗粒的质量控制方法。 方法采用薄层色谱(TLC)法对制剂中的天麻、五味子、麦冬进行定性鉴别；采用高效液相色谱(HPLC)法对天麻素及五味子醇甲进行含量测定。结果定性鉴定出制剂中的天麻、五味子及麦冬；经HPLC测定，结果显示天麻素在0.11～4.26 μg范围内线性关系良好，平均回收率为97.9%，重现性实验RSD为1.7%；五味子醇甲在0.07～4.50 μg范围内线性关系良好，平均回收率为96.7%，重现性实验RSD为1.3%。结论该方法可有效地控制复方天麻颗粒的质量。
       【关键词】  复方天麻颗粒； 薄层色谱法； 高效液相色谱法； 天麻素； 五味子醇甲
       Study on the Quality Standard of Compound Tianma Granule
       RONG Rong，CHEN Mingqiang，LI Hongxiao，YANG Yong
       
       (College of Pharmacology, Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan, Shandong 250355，China)
       Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard of Compound Tianma Granule. MethodsTLC was used to identify Rhizoma Gastrodiae, Fructus Schisandrae Chinensis and Raidix Ophiopogonis in this preparation. HPLC was used to determine the contents of gastrodine and schisandrin. ResultsGastrodine, deoxyschizandrin and the unique spot in Raidix Ophiopogonis could be detected by TLC. The linear range of gastrodine was within the range of 0.11～4.26 μg, the average recovery was 97. 9%, and RSD was 1.7%; the linear range of schisandrin was within the range of 0.07～ 4.50μg, the average recovery was 96.7%, and RSD was 1.3%.ConclusionThe methods can be used for the quality control of Compound Tianma Granule.
       Key words：Compound Tianma Granule;   TLC;   HPLC;   Gastrodine;   Schisandrin
       
       复方天麻颗粒由天麻、五味子、麦冬及甘油磷酸钠组成，用于治疗传出神经功能紊乱引起的头晕目眩、精神疲惫、神经衰弱等疾病。天麻为处方君药，天麻素为其主要有效成分，具有镇静、抗惊厥等药理作用［1］。五味子具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功能，五味子醇甲为其主要有效成分之一，有明显保肝、抗病毒、抗氧化、保护中枢神经系统以及安定作用［2］。为控制本品的质量，可采用分光光度法对制剂中甘油磷酸钠的含量进行质量控制［3］；本文则进一步对制剂中的天麻、五味子、麦冬进行了薄层色谱定性鉴别，采用高效液相色谱法测定了制剂中天麻素和五味子醇甲的含量。
       1  仪器与试药
       
       Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司；二极管阵列检测器；自动进样器)； Mettler AE 240电子天平（瑞士梅特勒公司）；ZF-I型三用紫外分析仪（上海隆拓仪器厂）；CQ-50超声清洗机（上海超声波仪器厂）。
       
       天麻素、五味子醇甲、五味子甲素(中国药品生物制品检定所，批号分别为： 110807-200205、110857-200405、110764-200107)；麦冬对照药材（中国药品生物制品检定所，批号为121013-200405）；乙腈、甲醇(色谱纯,天津市科密欧化学试剂开发中心)；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  色谱定性鉴别
       2.1.1  天麻的薄层鉴别［4］取本品1 g，研细，加20 ml水超声处理（功率250 W，频率20 kHz）20 min，滤过，滤液水浴蒸至近干，加少量水溶解，溶液加于大孔吸附树脂柱（DA201，柱长15 cm， 内径2.0 cm）上，加水50 ml洗脱（控制流速2 ml/min），弃去水液，再以10%乙醇80 ml洗脱，收集醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加70% 甲醇0.5 ml使溶解，作为供试品溶液；另取缺味配制的模拟制剂，同法制备，得阴性对照溶液；另取天麻素对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液10，10，5 μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（8∶1∶3∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无此特征斑点（见图1）。
       2.1.2  五味子的薄层鉴别［4］取本品1 g，研细，加三氯甲烷40 ml加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷0.5 ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺味配制的模拟制剂，同法制备，得阴性对照溶液。另取五味子对照药材1 g，同法制备，得对照药材溶液。再取五味子甲素对照品，加三氯甲烷制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。分别吸取上述溶液10，10，2，2   μl分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，至紫外灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无此特征斑点，见图2。
       图1  天麻的薄层色谱图（略）               
       图2  五味子的薄层色谱图（λ254检视）（略）
       2.1.3  麦冬的薄层鉴别   取本品1 g，研细，加3.6%盐酸60 ml加热回流1 h，冷却后滤过，滤液用氯仿萃取（20 ml×3）,合并氯仿层，水浴挥干，残渣加乙醇0.5 ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺味配制的模拟制剂，同法制备，得阴性对照溶液。再取麦冬对照药材1 g，同法制备，得对照药材溶液。吸取上述溶液各10，10，2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯-甲酸（4∶4∶0.4）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无此特征斑点，见图3。
       图3  麦冬的薄层色谱图（略）
       2.2  天麻素含量测定
       2.2.1  溶液的制备供试品溶液的制备：将本品研细，取约1 g，精密称定，精密加入50%乙醇50 ml，加热回流提取3 h，放冷再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液30 ml，浓缩至近干，残渣加乙腈-水（3∶97）混合溶液溶解，转移至10 ml量瓶中，并用乙腈-水（3∶97）混合溶液稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
       
       阴性对照溶液的制备：按处方比例并参照本品制备工艺，配制不含天麻的阴性样品，同法处理，制备成阴性供试品溶液，备用。
       
       对照品溶液的制备：精密称取天麻素10.65 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1 ml，置25 ml量瓶中，加乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）稀释至刻度，得浓度为42.6 μg/ml的对照品溶液。
       2.2.2  色谱条件［4］色谱柱：Phenomene C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）；检测波长为220 nm；流速为1 ml/min；进样20 μl；柱温：25 ℃。天麻素对照品溶液、供试品溶液、缺天麻阴性对照溶液的高效液相色谱图见图4。阴性对照品溶液在与对照品溶液相同保留时间位置上无吸收峰。
       2.2.3  线性关系考察   依据“2.2.2”项下色谱条件，以自动进样器精密吸取浓度为42.6 μg/ml的天麻素对照品溶液2.5，5，10，20，40，60，80，100 μl，依次注入高效液相色谱仪，测定天麻素色谱峰面积，以天麻素的进样量为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，进行回归分析，得到回归方程为Y=2 079.03X-40.02，相关系数r=1.000 0。结果表明，在上述色谱条件下，天麻素进样量在0.11～4.26 μg范围内线性关系良好。
       2.2.4  精密度实验精密吸取浓度为42.6 μg/ml的天麻素对照品溶液20 μl，注入高效液相色谱仪，测定，重复进样5次，结果分别为1 836，1 827，1 853，1 813，1 769，RSD=1.7%，结果表明仪器精密度良好。
       图4  天麻素含量测定的HPLC图（略）
       2.2.5  稳定性实验吸取“2.2.1”项下制备的供试品液，按上述色谱条件，每隔8 h测定一次天麻素色谱峰面积，考察供试品液在48 h内的稳定性，结果分别为2 155，2 556，2 578，2 534，2 632，2 688，RSD=2.6%（n=6），结果表明，供试品液的天麻素色谱峰面积在48 h内基本稳定。
       2.2.6  重现性实验取本品（批号060422）研细，取约1 g，平行5份，精密称定，按照“2.2.1”项下方法制得供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件，精密吸取20 μl注入高效液相色谱仪，测定天麻素的含量，测得本品每克含天麻素分别为0.99，0.96，1.00，0.99，1.00 mg，即天麻素平均含量为0.99 mg/g，RSD=1.9%（n=5）。结果表明，该实验操作重现性好，符合要求。
       2.2.7  回收率实验采用加样回收法。取已测知天麻素含量的样品（批号060422）研细，取约0.5 g，平行6份，精密称定，分别精密加入浓度为1.065 mg/ml的天麻素对照品溶液0.5ml，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件测定，求得平均回收率为97.9%，RSD=1.7%，结果见表1。结果表明，该实验方法测定天麻素含量准确度合格。
       
       回收率（%）=测得量-样品中的已知量加入对照品的量×100%
       表1  回收率实验结果（略）
       2.2.8  3批样品中天麻素的含量测定取批号分别为060429，060430，060501复方天麻颗粒3批，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.2”项下色谱条件测定天麻素的含量，结果分别为0.87，0.92，0.88 mg/g。
       图5  五味子醇甲含量测定的HPLC图（略）
       2.3  五味子醇甲含量测定
       2.3.1  溶液的制备供试品溶液的制备：取本品研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率20 kHz）20 min，取出，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液20 ml，浓缩至近干，残渣加甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
       
       阴性对照溶液的制备：按处方比例并参照本品制备工艺，配制不含五味子的阴性样品，同法处理，制备成阴性供试品溶液，备用。
       
       对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲15.01 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀（每毫升含五味子醇甲0.300 2 mg）；精密量取5 ml，置100 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升含五味子醇甲0.015 01mg）。
       2.3.2  色谱条件［4］色谱柱：Phenomene C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为甲醇-水（13:7）；检测波长为250 nm；流速为1 ml/min；进样20 μl；柱温：25 ℃。五味子醇甲对照品溶液、供试品溶液、缺五味子阴性对照溶液的高效液相色谱图见图5，阴性对照品溶液在与对照品溶液相同保留时间位置上无吸收峰。
       2.3.3  线性关系考察   依据“2.3.2”项下色谱条件，以自动进样器精密吸取浓度为0.300 2 mg/ml的五味子醇甲对照品溶液0.5，1，2.5，5，10，15 μl以及浓度为0.015 01 mg/ml的五味子醇甲对照品溶液5 μl依次注入高效液相色谱仪测定，以五味子醇甲的进样量为横坐标，五味子醇甲色谱峰面积为纵坐标，进行回归分析，得到回归方程为Y=3 404.1X-43.0，相关系数r=1.000 0。结果表明，在上述色谱条件下，五味子醇甲进样量在0.07～4.50 μg范围内线性关系良好。
       2.3.4  精密度实验精密吸取浓度为15.01 μg/ml的五味子醇甲对照品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，测定，重复进样6次，结果分别为1 080，1 091，1 072，1 042，1 092，1 058，RSD=1.8%，结果表明仪器精密度良好。
       2.3.5  稳定性实验精密吸取“2.3.1”项下制备的供试品溶液20μl，按上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定，每隔8 h进样一次，考察供试品液的稳定性，结果分别为1 378，1 418，1 398，1 356，1 433，1 422，RSD=2.1%（n=6），结果表明，供试品液的五味子醇甲色谱峰面积在48 h内基本稳定。
       2.3.6  重现性实验取本品（批号060422）研细，取约1 g，平行5份，精密称定，按照“2.3.1”项下方法制得供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件，精密吸取20μl注入高效液相色谱仪，测定五味子醇甲的含量，测得本品每克含五味子醇甲分别为0.48，0.49，0.50，0.51，0.49 mg，即五味子醇甲平均含量为0.49 mg/g，RSD=1.9%（n=5）。结果表明，该实验操作重现性好，符合要求。
       2.3.7  回收率实验采用加样回收法。取已测知五味子醇甲含量的样品（批号060422）研细，取约0.5 g，平行6份，精密称定，分别精密加入浓度为0.300 2 mg/ml的五味子醇甲对照品溶液0.9 ml，按照“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件测定，求得平均回收率为96.7%，RSD=1.3%，结果见表2。结果表明，该实验方法测定五味子醇甲含量准确度合格。
       表2  回收率实验结果（略）
       2.3.8  3批样品中五味子醇甲的含量测定取批号分别为060429，060430，060501复方天麻颗粒3批，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.2”项下色谱条件测定五味子醇甲的含量，结果分别为0.52，0.50，0.48 mg/g。
       3  讨论
       
       天麻素为天麻药材的主要有效成分，且以天麻药材为原料的药品国家标准中多以天麻素为指标制订薄层鉴别项，因此以天麻素为对照进行天麻薄层鉴别。为排除方中其他药味的干扰，用DA201大孔吸附树脂柱对供试液进行除杂。
       
       麦冬具有滋阴生津之功，麦冬皂苷是其主要有效成分之一。经过酸水解，麦冬皂苷水解为皂苷元，用氯仿萃取后，对其中的皂苷元进行薄层色谱分析。
       
       在天麻素供试品溶液的制备中，先后考察了不同的提取溶剂（无水乙醇、95%乙醇和50%乙醇）、不同提取方法（超声、加热回流）、不同的回流时间（1，2，3 h）对天麻素含量测定的影响最后选定供试液制备方法为50%乙醇加热回流提取3 h。
       
       在五味子醇甲供试品溶液的制备中，先后考察了不同提取方法（超声、加热回流）、不同的超声时间（10，20，30 min）、提取溶剂甲醇的不同用量（25，50，100 ml）对五味子醇甲含量测定的影响，最后选定供试液制备方法为50 ml甲醇超声处理20 min。
       【参考文献】
         　　［1］ 岑信钊. 天麻的化学成分与药理作用研究进展［J］.中药材，2005，28(10)：958.
       
       ［2］ 杨 放，袁 军，付 平. 五味子的研究概况［J］.华西药学杂志，2003,18(6)：438.
       
       ［3］ 容 蓉，陈明强，杨 勇，等.分光光度法测定复方天麻颗粒中甘油磷酸钠的含量［J］.山东中医药大学学报, 2007, 31(5)：413.
       
       ［4］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005:39,44.